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Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi.

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Presentazione sul tema: "Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi."— Transcript della presentazione:

1 Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi

2 Trasferimento secondo Southern (Southern blot)

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4 Non necessariamente i polimorfismi di restrizione (RSP) sono legati a mutazioni patogeniche, ma sono utili per caratterizzare alleli specifici

5 Slot blot ABCD Altra forma di ibridazione su membrana: lo slot blot (sia con campioni di RNA che di DNA)

6 Altre forme di ibridazione: libridazione in situ su cromosomi metafasici o interfasici (FISH-fluorescence in situ hybridization) Chromosome painting (verniciatura dei cromosomi) Sonda: insieme di sequenze ripetute caratteristiche di un cromosoma

7 La FISH su cromosomi metafasici permette di evidenziare eventuali anormalita cariotipiche quali traslocazioni, duplicazioni o polisomie Sonda: grandi frammenti genomici (cloni di YAC, cosmidi o fagi)

8 Altre forme di ibridazione: libridazione in situ su sezioni di tessuto Campione: mRNA presente nelle diverse cellule del tessuto Sonda: filamento anti-senso di uno specifico RNA

9 Trasferimento di RNA (Northern blot) Estrazione dellRNA Separazione tramite elettroforesi su gel denaturante Trasferimento su membrana Promozione di legame covalente con la membrana (cross- linking) Ibridazione con sonda specifica Visualizzazione del segnale (autoradiografia o colorimetria)

10 Quantificazione dellRNA tramite Northern blot Gel colorato con etidio bromuro Autoradiography of Target ctrl RNA 1,990 41,200 51,850 10,890 37,500 11,300 49,

11 Tecnica dellibridazione dellRNA (Northern) VANTAGGI: –Quantitativa –Provvede informazioni sul peso molecolare SVANTAGGI: –Richiede molto lavoro e tempo –Relativamente poco sensibile –Limitata dalla capacita di legame della membrana ALTERNATIVE: –RT-PCR –IBRIDAZIONE DI MICRO- O MACRO-ARRAYS

12 Saggi di ibridazione standard e inversa STANDARD:bersaglio non marcato legato a supporto solido, sonda marcata in soluzione –Southern blot –Northern blot –Colony o plaque lift –Ibridazione in situ su tessuto o su cromosomi INVERSA: sonda non marcata legata a supporto solido, bersaglio marcato in soluzione –Microarray o macroarray di DNA –Microarray di oligonucleotidi

13 Sia i macroarrays che i microarrays sono stati sviluppati per soddisfare lesigenza di misurare contemporaneamente lespressione di più geni. Entambe le tecnologie si basano sullo stesso principio: 1. Come sonda si usano olgonucleotidi o molecole di cDNA non marcati, immmobilizzati in posizioni precise di un supporto solido Array ABCD 2. Larray viene ibridizzato con una miscela complessa di molecole marcate rappresentative dellmRNA espresso dalle cellule in esame mRNA cDNA RT Nucleotidi marcati

14 Macroarray Le molecole sonda vengono legate a membrane di nylon Come tracciante viene utilizzata la radioattività Analisi di qualche decina o poche centinaia di geni Paragone tra lintensita dei segnali ottenuti con campioni marcati diversi

15 MICROARRAY A OLIGONUCLEOTIDI (tecnologia Affymetrix): Le molecole sonda sono oligonucleotidi sintetizzati direttemente su microchip di silicio Su ogni microchip vengono sintetizzati fino a oligonucleotidi diversi. La metodica è stata sviluppata in modo da permettere misurazioni assolute dellabbondanza dei singoli mRNA

16 Microrray di cDNA (o di oligonucleotidi lunghi) Le molecole sonda sono cDNA o oligonucleotidi lunghi paia di basi, sintetizzati tradizionalmente e legati ad un vetrino da microscopio per mezzo di un processo di stampa a getto (spotting) Su ogni vetrino trovano posto fino a geni. Si effettuano misurazioni comparative, non assolute

17 mRNA Reverse transcription Labeled 1 1 st strand cDNA Hybridization on the cDNA microarray Sample 1 (test) Sample 2 (reference)

18 Lenorme numero di geni analizzati dai microarray è il punto più forte, ma anche più debole della metodica. Infatti sono possibili moltissimi errori (importanza di avere campioni replicati), e il trattamento dellinformazione non è banale! Lacquisizione dei dati è solo la parte iniziale della procedura. La parte più complicata è lelaborazione della enorme quantità di dati generati da questi esperimenti, necessaria per rispondere ai quesiti biologici di partenza. I dati più significativi devono essere poi verificati con altri sistemi (northern, real time RT-PCR) Attenzione !!!

19 Applicazioni 1.Definizione delle basi molecolari e identificazione di nuovi markers prognostici per neoplasie e altre patologie 2.farmacogenomica

20 Sequenziamento del DNA Metodo enzimatico (Sanger) Si eseguono 4 reazioni di polimerizzazione separate

21 Sequenziamento del DNA Metodo enzimatico (Sanger)

22 Amplificazione di una sequenza di DNA tramite la reazione polimerasica a catena (PCR)

23 PCR VANTAGGI: Sensibilita Rapidita Si presta allanalisi simultanea di molti campioni (high throughput) Si presta allanalisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso campione Si presta allanalisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o fissato SVANTAGGI: Sensibilita (rischio di contaminazioni-falsi positivi) Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) Può sintetizzare frammenti relativamente corti La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza(la Taq pol non possiede attività 3->5 esonucleasica)

24 Esempi di utilizzo della PCR Su DNA: –segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA –Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da clonare Su RNA messaggero (RT-PCR): –segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi) –Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da clonare - isolare cDNA specifici per determinati geni.

25 PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA: PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR) Estrazione dellRNA Purificazione dellRNA poliadenilato (mRNA) Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesto specifici Analisi dei prodotti dellamplificazione (elettroforesi)

26 RT-PCR utilizzata per quantificare uno specifico mRNA Reazione analizzata a compimento : –PCR non competitiva (semiquantitativa-controllo interno) –PCR competitiva (utilizza un competitore interno o MIMIC) Reazione analizzata in tempo reale : –Utilizza lamplificazione specifica con oligonucleotidi fluorogenici. Lamplificazione puo essere seguita mentre avviene, eliminando lappiattimento dei risultati dovuto al raggiungimento della saturazione. Lintensita della fluorescenza misurata corrisponde alla quantita di prodotto amplificato.

27 RT-PCR in tempo reale Utilizza particolari combinazioni di coloranti fluorescenti accoppiati agli oligonucleotidi, la cui fluorescenza viene smascherata quando loligonucleotide e incorporato nella catena di DNA sintetizzata durante la reazione di amplificazione. Lutilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza

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29 I prodotti di PCR possono essere clonati:

30 Uso della PCR per mappare, evidenziare e caratterizare mutazioni note o meno: Amplicazione e sequenziamento delle sequenze codificanti un determinato gene Rilevazione dei polimorfismi per i siti di restrizione Amplificazione allele-specifica Camminare lungo il genoma per individuare geni mutati

31 La PCR può essere utilizzata per lo screening di mutazioni geniche, a partire sia da DNA genomico che da RNA

32 La PCR può essere utilizzata per lanalisi di polimorfismi per i siti di restrizione (RFLP)

33 Amplificazione allele-specifica (ARMS – amplification refractory mutation system)

34 Chromosome walking:


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