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A SSORBIMENTO TRANSIENTE IN MIOGLOBINA FOTOLIZZATA Laureando: Fabrizio Pittorino Relatore: Tullio Scopigno.

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Presentazione sul tema: "A SSORBIMENTO TRANSIENTE IN MIOGLOBINA FOTOLIZZATA Laureando: Fabrizio Pittorino Relatore: Tullio Scopigno."— Transcript della presentazione:

1 A SSORBIMENTO TRANSIENTE IN MIOGLOBINA FOTOLIZZATA Laureando: Fabrizio Pittorino Relatore: Tullio Scopigno

2 Scopo della dissertazione: studiare la cinetica ultraveloce della mioglobina in seguito alla fotodissociazione del ligando. Funzione fisiologica della mioglobina: legare reversibilmente lossigeno. E unemoproteina: il sito attivo è leme: Fe coordinato con i 4 atomi di azoto di una porfirina. Il Fe può essere 6-coordinato (mioglobina legata) o 5-coordinato (mioglobina non legata). L A MIOGLOBINA 4/11/2011 Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Stati eccitati transienti a vita ultrabreve (fs, ps) Ricombinazione geminata (reazione in soluzione acquosa) sulla scala del ns Fotolisi (impulso elettromagnetico) t < 50 fs CO

3 S CHEMA PUMP E PROBE 4/11/2011 Gli impulsi di pump e di probe sono focalizzati sul campione. Impulso di pump: ultracorto, utile alla fotolisi. Impulso di probe: utile allo studio dello spettro di assorbimento transiente del sistema. Quantità di interesse: differenza di assorbanza del probe in presenza e in assenza del pump: Variando la lunghezza donda del probe e il suo ritardo temporale rispetto allimpulso di pump si ottiene lo spettro di assorbimento transiente del sistema, in cui è funzione del tempo e della lunghezza donda. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata PUMP PROBE

4 A PPARATO SPERIMENTALE 4/11/2011 Laser a Ti:Sa centrato a 800 nm e con frequenza di 30 fs. Impulso di pump ottenuto tramite OPA a 540 nm per massimizzare la fotolisi Impulso di probe tramite dispersione non lineare in cristallo di CaF2 Delay line permette di regolare il ritardo tra pump e probe. Chopper tarato a 500 Hz permette larrivo a intermittenza del pump sul campione. Monocromatore e CCD raccolgono lo spettro di assorbimento transiente tra 400 e 700 nm Campione di mioglobina nelle forme legata e non legata. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Come si presentano i dati:

5 L E IPOTESI : PARALLELA E SEQUENZIALE 4/11/2011 Fotolisi: meno di 50 fs. Ipotesi per la cinetica delleme in seguito alla fotolisi del CO in termini dellapparizione di stati eccitati delleme non legato: Mb1 e Mb2. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Mb1 è creato istantaneamente, decade contemporaneamente nello stato fondamentale e in Mb2. Mb2 non è creato istantaneamente! k10, k12 e k20 frequenze di transizione Mb1 decade con = 300 fs allo stato fondamentale della proteina non legata. Mb2 si rilega con il CO con = 3 ps. Ricombinazione geminata tra Mb e CO sulla scala del nanosecondo. Canale di formazione di Mb2 inibito nella MbCO. Mb2 Mb1 MbCO Mb Mb1 Mb2 Mb MbCO

6 M ODELLO PER L IPOTESI SEQUENZIALE 4/11/2011Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Proponiamo un modello per lipotesi sequenziale: Soluzione Condizioni iniziali Nonostante tre frequenze di transizione, solo due tempi caratteristici del sistema! Autovalori: Autovettori:

7 A NALISI DATI : P RESENTAZIONE 4/11/2011 Spettro di assorbimento transiente della mioglobina non legata: in funzione di e t. Chirp temporale: dovuto alla variazione dellindice di rifrazione con (…e visibile data lelevata risoluzione temporale)! Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Possibile eliminazione del chirp tramite routine scritta su MatLab.

8 A NALISI DATI : P RESENTAZIONE 4/11/2011 Risultato delleliminazione del chirp nello spettro della mioglobina non legata. Picchi: nascita di: Mb1 (462 nm) Mb2 (448 nm) Scomparsa dello stato fondamentale (435 nm). Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Analogamente per la proteina legata con il CO: Assenza di picco a 448 nm (Inibizione di formazione Mb2) Baseline rappresenta la lenta ricombinazione geminata.

9 A NALISI DATI : A SINGOLA LUNGHEZZA D ONDA (M B ) 4/11/2011 Un primo approccio può essere eseguire fit a singola lunghezza donda sui picchi di assorbimento delle specie transienti (problema delle code). In accordo col nostro modello, fit bi-esponenziali. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Mb: 435 nm Mb2: 448 nm Mb1: 462 nm

10 A NALISI DATI : A SINGOLA LUNGHEZZA D ONDA (M B CO) 4/11/2011Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Analoghi risultati per la mioglobina legata con il monossido di carbonio. Per rappresentare la ricombinazione geminata bisogna inserire una baseline. Mb: 435 nm Mb2: 448 nm Mb1: 462 nm

11 A NALISI GLOBALE : SVD 4/11/2011 La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa lestrazione dellinformazione lontano dai picchi di assorbimento. Una possibile soluzione è effettuare unanalisi simultanea su tutte le lunghezze donda. Lanalisi globale è condotta usando il pacchetto MatLab Ultrafast Toolbox. Primo passo: SVD. Questo tipo di analisi permette la stima del numero di processi attivi del sistema decomponendo la matrice dei dati in spettri di base pesati. Quelli con peso maggiore rappresentano il segnale, gli altri sono rumore. Risultati per la mioglobina non legata: Si confermano due processi dominanti… e un terzo non trascurabile. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata

12 A NALISI GLOBALE : G LOBAL F IT 4/11/2011 Global fit: fit simultaneo su tutte le lunghezze donda, che ha come parametri i tempi caratteristici corrispondenti ai processi attivi del sistema e a ognuno di essi associa uno spettro indipendente dal tempo. I dati possono essere ricostruiti secondo la formula: Dati caricati: Un processo in più. … I tempi caratteristici sono sovrastimati! Questo è imputabile alla presenza del cooling vibrazionale (il terzo processo). Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata

13 C OOLING VIBRAZIONALE 4/11/2011 La foto-eccitazione allorigine delle specie elettroniche ha come risultato specie vibrazionalmente calde. I picchi di assorbimento di queste si spostano quindi nel tempo, raffreddandosi. Fit con combinazione lineare di gaussiane permette di estrarre la posizione dei picchi Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Spostamento dei picchi nel caso della mioglobina non legata. Spostamento del picco nel caso della mioglobina legata. Tempi caratteristici paragonabili a quelli della foto-cinetica Possibile distorsione dovuta a Mb2

14 C ONCLUSIONI 4/11/2011Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata Il nostro studio, effettuato sia tramite fit a singola lunghezza donda sia con fit simultanei su tutto lo spettro di assorbimento transiente, conferma lapparizione di due stati eccitati in seguito alla fotolisi e il loro decadimento sequenziale verso lo stato fondamentale. Il cooling vibrazionale è unulteriore complicazione allinterpretazione dei dati e ne abbiamo studiato le dinamiche, evidenziando di lavorare con stati delleme vibrazionalmente caldi, sia per lo stato fondamentale sia per gli stati eccitati. Ci siamo occupati di studiare nel dettaglio la cinetica ultraveloce della mioglobina in seguito alla fotolisi del ligando CO.

15 A NALISI DATI : P RESENTAZIONE 27/10/2011 Traccia temporale a 435 nm nel caso della proteina non legata: Assorbimento transiente in funzione della lunghezza donda a tempi selezionati. Assorbimento transiente in mioglobina fotolizzata

16 SVD E GLOBAL FIT La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa lestrazione dellinformazione lontano dai picchi di assorbimento. Singular value decomposition: decompone i dati vvvvv nel modo seguente: dove S è una matrice diagonale mxn che contiene le singular values, U le tracce nel dominio del tempo e V quelle nel dominio spettrale. Decomposizione di una matrice in somma pesata di matrici di base. Matrici separabili, possono essere scritte come prodotto esterno di due vettori: o in coordinate: Si ottiene così: dove le rappresentano le singular values. Base di componenti ortogonali che può riprodurre i dati tramite combinazione lineare (non hanno necessariamente un significato fisico). Le componenti della base corrispondenti alle SV più alte rappresentano il segnale, le altre il rumore. Permette di estrarre il numero dei processi attivi presenti nei dati.

17 SVD E GLOBAL FIT La sovrapposizione degli spettri di assorbimento delle specie transienti rende difficoltosa lestrazione dellinformazione lontano dai picchi di assorbimento. Global fit permette di estrarre costanti di tempo e spettri indipendenti del tempo corrispondenti ai processi attivi presenti nei dati. Pacchetto Ultrafast Toolbox: algoritmo patternsearch per la ricerca del minimo assoluto della somma dei residui dove è la matrice dei dati aspettata. Il problema è multidimensionale (su tutte le lunghezze donda) minimizzazione su una ipersuperficie. Nella spettroscopia ultraveloce i dati di assorbimento transiente sono descritti da: dove le sono gli spettri funzione di e indipendenti dal tempo. I sono le costanti di tempo corrispondenti e sono i parametri di fit. Lo scopo è dunque trovare questi due parametri. Tramite SimBiology si può caricare il modello tramite il quale si effettuerà il global fit sui dati (prima profili di concentrazione, poi fit sui dati).


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