L'induzione dei geni vir induce la formazione di una copia a singolo filamento del T-DNA, T-strand. Il T-strand, complementare al filamento codificante.

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1 L'induzione dei geni vir induce la formazione di una copia a singolo filamento del T-DNA, T-strand. Il T-strand, complementare al filamento codificante del T-DNA, si forma ad opera di due endonucleasi specifiche per LB e RB: VirD1 e VirD2. Queste rimangono attaccate all'estremita' 5' del filamento. In seguito alla ricostituzione del filamento complementare del T-DNA, ad opera del sistema di riparo della cellula batterica, si excide un filamento ss del T-DNA con la proteina VirD2 attaccata all'estremita' 5' che le conferisce una polarita'. Il T-strand viene immediatamente ricoperto da ss-binding proteins codificate da VirE che proteggono il T-strand dall'attacco di proteasi e gli conferiscono una forma bastoncellare che ne facilita l'ingresso nella cellula vegetale utilizzando un pilus formati dall'assemblagio di proteine codificate dal locus VirB.

2 L'intero processo di attraversamento del canale richiede energia probabilmente fornita dall’attivita' ATPasica di VirB4 e/o VirB11 La traslocazione del complesso-T al nucleo sembra essere mediato sia da VirD2 che da VirE2. Entrambe le proteine, infatti, presentano Nuclear Localization Signals (NLS) funzionali. Dopo aver raggiunto la membrana nucleare, il complesso-T entra nel nucleo e, una volta dentro il nucleo, il T-strand si integra casualmente nel genoma vegetale con un meccanismo in gran parte sconosciuto, che sicuramente coinvolge numerose proteine vegetali e, forse, Vir D2 eVirE2.

3 Segnali polifenolici nella pianta
VirA VirG Recettori veetali vitronectina-like VirB VirE2

4 La sindrome crown gall Il T-DNA integrato nelle cellule vegetali presenta tre classi di geni: geni che codificano per l’ormone vegetale auxina il gene che codifica per l’ormone vegetale citochinina geni che sintetizzano degli zuccheri coniugati ad aa detti opine I fitormoni aux e ck sono sintetizzati utilizzando vie metaboliche di origine batterica. L’aux è sintetizzata dai geni IaaM e IaaH che codificano per la trp mono-ossigenasi e per la 3-indol acetamide idrolasi, mentre la CK è sintetizzata dal gene ipt che codifica per la isopentenil-transferasi. Queste attività enzimatiche permettono la proliferazione delle cellule trasformate. Le cellule trasformate sintetizzano anche le opine, che gli Agrobatteri utilizzano come fonte di energia, e queste tre classi di geni costituiscono un sistema che favorisce selettivamente la crescita di A.tumefaciens.

5 Mappa del plasmide Ti di Agrobacterium tumefaciens
LB RB T-DNA Traferimento coniugativo Regione vir Plasmide Ti Catabolismo opine

6 Dai plasmidi Ti vengono derivati vettori di trasferimento in cellule vegetali
I plasmidi Ti e Ri non sono adatti ad essere usati come vettori di trasferimento, perché: sono troppo grandi non hanno siti di restrizione adatti per i clonaggi molecolari inducono tumori vegetali non rigenerabili come piante fertili. L’analisi molecolare dei plasmidi Ti ha dimostrato che, mentre RB e LB sono essenziali per il trasferimento del T-DNA, paradossalmente il T-DNA stesso non lo è. E’ stato dimostrato sperimentalmente che qualunque sequenza di DNA inclusa tra le border repeats (LB e RB) viene trasferita nelle cellule vegetali dall’apparato di trasferimento di Agrobacterium

7 Un vettore Ti disarmato
(non oncogenico) pGV3850 nos pBRR322 LB RB pGV3850 Traferimento coniugativo Regione vir Catabolismo opine

8 Utilizzo dei vettori disarmati: produzione di T-DNA ricombinante
attraverso la formazione di un cointegrato I primi plasmidi Ti disarmati non poterono essere usati direttamente come vettori perchè, sebbene non virulenti, condividevano con i plasmidi Ti originari le grandi dimensioni e l’assenza di siti di restrizione unici adeguati. Tuttavia questi plasmidi sono stati utilizzati come vettori di trasferimento vegetale di prima generazione sfruttando la ricombinazione omologa tra sequenze in comune con plasmidi di clonaggio e selezionando per eventi di cointegrazione.

9 I geni da trasferire nelle cellule vegetali venivano clonati in normali vettori di clonaggio, per esempio PBR322. Si procedeva quindi al trasferimento in Agrobacterium del vettore disarmato (es. pGV3850) e del vettore di clonaggio (pBR322). Questo trasferimento viene di solito effettuato per coniugazione. All’interno dell’Agrobacterium può verificarsi, tra l’altro, una ricombinazione omologa tra le regioni di pBR322 in comune tra pGV3850 e pBR322 con formazione di un cointegrato che viene selezionato per la presenza contemporanea dei marcatori Ampicillina e Kanamicina.

10 per ricombinazione omologa e cointegrazione
Trasferimento genico per ricombinazione omologa e cointegrazione Ap Km Gene eterologo RB LB Regione vir Traferimento coniugativo Catabolismo opine RB LB Regione vir Traferimento coniugativo Catabolismo opine Cointegrato

11 Il sistema puo' essere scomposto in 3 componenti essenziali:
I border repeats che delimitano e definiscono il T-DNA La regione Vir, che comprende la maggior parte dei geni coinvolti nel trasferimento del T-DNA Alcuni loci cromosomali di Agrobacterium, come Att o chv, anch'essi associati alla virulenza (chv sta per chromosomal virulence)

12 I vettori binari Il sistema mediato dai vettori binari, sfruttando la capacita' dei geni vir di agire in trans, utilizza due vettori separati: uno contenente solo i geni vir, residente stabile in un Agrobacterium tumefaciens "disarmato", e un altro contenente essenzialmente i due border repeats, un polilinker ed un marker di selezione. Uno dei vettori binari più diffusi è pBin19 un plasmide di 11 Kb. Questo vettore deriva dal plasmide a largo spettro d'ospite pRK252, del quale sono state mantenute le origini di replicazione e coniugazione. A pRK252 sono state aggiunti il gene per la resistenza alla kanamicina (nptII) ed un MCS contenente il gene per la b-galattosidasi. Infine sono state aggiunte la RB e la LB e al loro interno, il polilinker ed un gene di resistenza alla kanamicina sotto controllo di un promotore vegetale.

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14 Evoluzione dei vettori di trasferimento vegetale
Le principali modifiche consistono in: Origini di replicazione a più alto numero di copie Repliconi più stabili Dimensioni più piccole Polilinker più grandi e maggior numero di siti unici per enzimi di restrizione Maggior numero di possibili marcatori di selezione Possibilità di utilizzare diversi geni reporter (GUS, GFP, YFP, Luc) Vettori completamentamente sequenziati

15 GFP

16 COME SI TRASFORMANO LE PIANTE
La creazione di piante transgeniche per un gene di nostro interesse implica tre fasi fondamentali: Clonare il nostro gene, in un vettore binario e trasformare E.coli Trasferirlo in Agrobatterium tumefaciens Utilizzare questo Agrobatterio modificato per trasferire il nostro gene in cellule vegetali, selezionando le cellule trasformate da quelle normali e rigenerando da queste piante transgeniche Quindi: prima si inserisce il gene in un vettore binario, si trasferisce il costrutto in E.coli e si trasferisce nuovamente il costrutto in un Agrobatterio disarmato. Una volta ottenuto e controllato il ceppo di Agrobatterio ricombinante, si utilizza per infettare cellule vegetali. Esistono vari sistemi utilizzabili per questo scopo; fra i piu' diffusi i dischi fogliari o protoplasti.

17 excisione di dischi fogliari
di circa 2 mm Breve incubazione dei dischi fogliari con una coltura di Agrobatteri (5-10 x 106/ml) contenenti il gene d’interesse clonato in un vettore binario Co-coltivazione in terreno a basso rapporto auxina/ citochinina, in presenza di carbellicina e di Km Dopo la germinazione i trasformanti si trasferiscono in terreno di radicazione

18 Metodi alternativi di trasferimento genico vegetale:
elettroporazione E’ possibile trasformare specie monocotiledoni con Agrobacterium ma, l’efficienza è molto bassa, dunque, nonostante l’interesse agronomica di queste specie, l’uso di Agrobacterium non è consigliabile. Un metodo poco efficiente, consiste nell’ottenere protoplasti per poi trattarli sostanzialmente come cellule di mammifero cioè, per esempio, con Ca3 (PO4)2 . Un modo più efficace consiste nell’introduzione diretta del DNA usando metodi fisico-chimici Il metodo più efficace è l’elettroporazione di protoplasti. Un’ alta concentrazione di DNA viene mescolata a una sospensione di protoplasti e sottoposta ad un intenso campo elettrico dell’ordine di V/cm. Efficienza di trasformazione: 0,1-l’1% x protoplasti di riso e di mais

19 Metodi alternativi di trasferimento genico vegetale:
cannoncino balistico Tessuto vegetale bersaglio Promotore per cellule vegetali gene d’interesse Ap ori Microparticelle (1µm) di tungsteno Precipitazione del DNA sulle microparticelle Caricamento del cannoncino balistico Piastra di trattenimento Percussore Carica a salve microproiettile microparticelle rivestite di DNA

20 Come si trasforma Arabidopsis?
“In planta Agrobacterium gene-transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants” Infiltrazione sotto vuoto in piante a fiore di Arabidopsis con una sospensione di Agrobacterium trasformato con un vettore binario Efficienza di trasformazione variabile da 200/1000 trasformanti/pianta, dipendente da diversi fattori: Stadio di sviluppo della pianta Concentrazione dell’Agrobacterium (OD>.8) Tempo di incubazione sotto vuoto (=20 min.) Vettore binario utilizzato

21 La trasformazione di Arabidopsis thaliana:
Infiltrazione sotto vuoto con Agrobacterium

22 Come avviene la trasformazione???
I trasformanti sono emizigoti per l’evento di inserzione (per il T-DNA) Ogni trasformante è frutto di un evento indipendente La trasformazione riguarda sia i tessuti vegetativi che quelli riproduttivi Qual è l’organo/i riproduttivo/i che viene trasformato?

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24 Uso di un gene reporter nel T-DNA per evidenziare la trasformazione

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