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POSIZIONAMENTO DEI NUCLEOSOMI A)Sequenze preferenziali per la formazione dei nucleosomi B)Elementi di sequenza e strutturali che escludono i nucleosomi.

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1 POSIZIONAMENTO DEI NUCLEOSOMI A)Sequenze preferenziali per la formazione dei nucleosomi B)Elementi di sequenza e strutturali che escludono i nucleosomi (es. elementi di confine).

2 Posizionamento dei Nucleosomi Rispetto ad una Sequenza Il DNA nucleosomizzato viene trattato con Nucleasi Micrococcale Estrazione del DNA monomerico E trattamento con R Elettroforesi Blot Ibridazione Nucleosoma in fase rispetto ad una sequenza R taglia in un solo punto della sequenza monomerica Nucleosoma non in fase rispetto ad una sequenza a) b)

3 Posizionamento TraduzionalePosizionamento Traslazionale Posizionamento rispetto ad un elemento di sequenza. La particolare sequenza può essere inclusa o esclusa dal nucleosoma Posizionamento rispetto alla fase dellelica. La sequenza può trovarsi rivolta verso linterno o verso lesterno sulla superficie del nucleosoma Il Posizionamento dei nucleosomi presenta risvolti importanti per quanto riguarda la trascrizione genica

4 Paradosso del Numero di Legame Ogni ottamero rilascia 1 giro di superelica Il DNA si avvolge di 1.8 giri intorno allottamero Lk = Tw + Wr La variazione del passo dellelica spiega parzialmente il paradosso.

5 DNasi I Il nucleosoma reagisce al taglio solo su determinati siti. Periodicità di taglio = Periodicità strutturale (passo dellelica)

6 Accessibilità del DNA nucleosomale alla DNasi I Il profilo di taglio identifica una serie definita di siti bersaglio che riflettono specificamente la geometria del nucleosoma, in particolare la disposizione del DNA sulla superficie.

7 DNasi I: analisi ad alta risoluzione La stessa tecnica si può applicare a DNA marcato e ricostituito con particelle core nucleosomali.

8 Ogni sito di taglio non dà una banda netta ma una piccola famiglia di bande. Il passo dellelica del DNA cambia rispetto a quello che si ha in soluzione In media la periodicità è minore e passa da 10.5bp/giro a bp/giro In particolare: Allestremità del nucleosoma il passo dellelica è minore (circa 10.0bp/giro) e aumenta verso il centro della particella (circa 10.7bp/giro) Questo spiega in parte il Paradosso del Numero di Legame in base allequazione ΔL = ΔT + ΔW ~ 10.0bp ~ 10.7bp ~ 10.0bp

9 H1 e la formazione di strutture di ordine superiore

10 Secondo Livello: Fibra da 30nm COME SI PASSA DALLA FIBRA DA 10nm ALLA FIBRA DA 30nm?

11 Cromatina che fuoriesce da nuclei lisati: fibra da 30nm Cromatina trattata con nucleasi micrococcale: fibra da 10nm La Cromatina è composta di particelle discrete

12 Cromatosoma 5 mM 1 mM Il complesso di un nucleosoma con listone H1 è chiamato cromatosoma e contiene 168bp di DNA + ottamero istonico + istone linker H1 Listone linker verosimilmente dirige il posizionamento relativo di nucleosomi successivi e il profilo dei contatti nucleosoma-nucleosoma H3 H1 N H3 C

13 Listone linker: H1 H1: FAMIGLIA ISTONICA Nel Topo: H1° espresso nello sviluppo H1t specifico del testicolo H1b coinvolto nellapoptosi indotta da raggi X Le funzioni dellistone H1: Stabilizzare la fibra da 30nm (punto ancora controverso); Minimizzare lo slittamento nucleosomale; Cambia la ripetizione nucleosomale; Effetti sullattività trascrizionale. Il legame di H1 al nucleosoma è altamente dinamico. Modello STOP-AND-GO: H1 viene continuamente scambiato. Questo suggerisce che esso deve contribuire alla dinamica di folding-unfolding della fibra.

14 Collana di perleNucleosomi aggregati Modello folding-unfolding della cromatina e ruolo di H1 Non cè formazione di fibre spesse organizzate bene Lalta concentrazione salina aiuta gli istoni del core nelle interazioni nucleosoma- -nucleosoma 20nm30nm Si formano strutture ordinate da 20nm e 30nm H1 si dissocia Hizume K. Et al. (2005) Biochemistry 44,

15 Analisi geometrica di immagini ottenute in AFM Le fibre di cromatina mostrano diversi stati conformazionali che dipendono da sottili cambiamenti nellambiente circostante

16

17 Emergono due possibili classi di modelli per la fibra da 30nm: 1)Elica solenoidale (tecnicamente definita one-start), in cui i nucleosomi sono avvolti in maniera lineare. Evidenze a favore di questo modello: a) Diametro invariante rispetto alla lunghezza del DNA linker b) Aumentato compattamento per fibre con 6 o più nucleosomi c) Necessità di un DNA linker superavvolto (Robinson et al., 2006) 2)Nastro a zig-zag (definito two-start), in cui il nastro si piega e si superavvolge. Evidenze a favore di questo modello: a) Variazione del diametro della fibra al variare del linker b) Percorso a zig-zag dei nucleosomi c) DNA linker non strettamente piegato (Schalch et al., 2005)

18 One-start: modello solenoidale della fibra da 30nm Polinucleosomi ricostituiti con lunghezze variabili del DNA linker Condizioni saline fisiologiche Presenza dellistone H1 Tecnica della microscopia elettronica Lapproccio non fornisce informazioni precise sul percorso del DNA linker ma la costanza delle dimensioni suggerisce che esso sia ripiegato allinterno della fibra in maniera continua e regolare. La compattazione è migliore in presenza dellistone linker

19 Tetranucleosoma ricostituito analizzato con la diffrazone alla risoluzione di 9Å LS: linker dritto LB: linker piegato La presenza di due differenti conformazioni del linker suggerisce che il dinucleosoma possa rappresentare meglio lunità ripetitiva della struttura di ordine superiore Le analisi su questa struttura favoriscono il modello a zig-zag per il DNA linker. Non definisce chiaramente il ruolo dellistone linker. Two-start helix: modello a zig-zag della fibra da 30nm

20 In Xenopus laevis listone B4 è lunico istone presente nelluovo e viene Rimpiazzato da sottotipi somatici di H1 (H1A) in concomitanza con lattivazione genica zigotica. Leffetto repressivo di B4 è più debole di quello di H1 somatico. B4 potrebbe contribuire direttamente alla dinamicità della cromatina nellembriogenesi precoce. B4 differisce da altre varianti per la composizione del tratto C-terminale e la sua basicità è anche ridotta. Questo aspetto viene studiato utilizzando un metodo di assemblaggio della cromatina che fa uso di NAP-1 (nucleosome assembly factor-1), una proteina chaperone per gli istoni H2A e H2B, ma che viene dimostrata funzionare anche come chaperone per B4 e H1A.

21 H1A protegge il DNA linker dalle nucleasi al contrario di B4, quindi la struttura è più compatta. Entrambi, come atteso, legano il nucleosoma al livello dellasse diadico. Quindi B4 non riduce laccessibilità del dinucleosoma e permette quindi un più facile rimodellamento della cromatina. Accessibilità alla DNAsi del dinucleosoma ricostituito

22 NAP-1 funziona come chaperone e come scambiatore che facilita il Reclutamento di complessi di remodeling che modulano regionalmente listone linker nel nucleo

23 H1 ha un ruolo importante ma NON è il maggiore determinante della struttura della cromatina Le cellule compensano la perdita di H1 attraverso maniere alternative di condensare il DNA, ad esempio: Tetrahymena senza H1 presenta nuclei allargati e cromatina meno condensata; Topo senza H1 presenta laumento del numero di ottameri istonici e la diminuzione del DNA linker. H1 mostra quindi una grande importanza nello stabilizzare piuttosto che nel formare la fibra da 30 nm. Perciò la condensazione potrebbe non richiedere lassociazione permanente di H1 con la cromatina.

24 Le interazioni elettrostatiche tra nucleosomi contribuiscono grandemente alla compattazione della fibra cromatinica. La coda N-terminale di H4 di un nucleosoma interagisce con gli istoni H2A del nucleosoma successivo I residui sono fondamentali e in particolare la K16 K16 acetilata destabilizza i contatti nucleosoma-nucleosoma H2A contiene un acidic-patch che è responsabile dellinterazione Questo può variare suggerendo un ruolo regolativo di H2A Interazioni nucleosoma-nucleosoma

25 Nonostante la stabilità del nucleosoma e dellalto grado di compattezza nel nucleo la cromatina è sorprendentemente dinamica. Esistono vari modi di modificare la cromatina e rispondere alle necessità della cellula di regolare i processi biologici dallespressione genica, alla riparazione del DNA, alla replicazione e ricombinazione. 1)Uso di varianti istoniche, in particolare varianti di H2A e H3. 2)Modificazioni epigenetiche degli istoni: acetilazione, metilazione ed altre. 3)Uso di sistemi di rimodellamento che cambiano la stabilità e/o la posizione del nucleosoma. Dinamicità della cromatina

26 VARIANTI ISTONICHE S viene fosforilata in seguito a danni al DNA §: differenze in questo loop prevengono lassemblaggio di un nuc. contenente H2A e H2A.Z #: questo dominio contatta (H3-H4) 2 e variazioni qui influenzano la stabilità del nucleosoma. § # Le varianti istoniche sono coinvolte in vari processi, sia nella espressione genica, sia nella riparazione del DNA, sia nella definizione di strutture eterocromatiche.

27 H2A.Z In lievito: a)è richiesto per lespressione di circa 200 geni b)limita lespansione delleterocromatina costituita dal complesso SIR In mammifero: promuove la formazione delleterocromatina (altera la superficie del nucleosoma per promuovere il folding mediato da HP1 - Fan J.Y. 2004) In Drosophila: H2Av = H2A.Z, si localizza sulleterocromatina e promuove il silenziamento genico H2A.X Questa variante è coinvolta nella riparazione del DNA. Appare nei nucleosomi fiancheggianti le rotture a doppio filamento. Funziona come marker per lesioni al DNA H2ABbd (Barr body deficient) In questa variante la natura acidica è ridotta. È ampiamente assente dai Corpi di Barr. macroH2A Arricchito nei corpi di Barr e coinvolto nellinattivazione del cromosoma X

28 Gli istoni e le loro varianti possono essere scambiate in un processo mediato da proteine. Ad esempio lo scambio del dimero H2A-H2B avviene regolarmente con il procedere della trascrizione: 1)RNA polimerasi II può da sola spiazzare il dimero H2A-H2B 2)FACT (Facilitates Chromatin Trx) spiazza H2A-H2B 3)Spt6 aiuta il riposizionamento di dimeri H3-H4 Dati per lo scambio di H2A.Z nella trascrizione: In lievito H2A.Z viene depositato preferenzialmente nei promotori, quindi avrebbe un ruolo positivo nella trx (Larochelle, 2003) H2A.Z viene spiazzato nella regione interna trascritta (Farris2005) SCAMBIO DELLE VARIANTI ISTONICHE NELLA CROMATINA

29 Chaperone istoniche mediano lo scambio tra istoni e varianti istoniche NAP-1: 1)Facilita il legame di fattori di trx rimuovendo il dimero H2A-H2B 2)Può rimuovere o rimpiazzare H2A da nucleosomi ricostituiti 3)Aiuta lo sliding dei nucleosomi rimuovendo transientemente H2A-H2B 4)Si trova spesso associato al dimero H2A-H2A.Z e scambia anche questo HIRA: histone regulatory homolog A e ASF-1a : anti silencing function 1a incorporano macroH2A nei foci di eterocromatina associati alla senescenza HIRA incorpora anche H3.3

30 I RIMODELLATORI DELLA CROMATINA ATP-DIPENDENTI SONO IN GRADO DI MOBILITARE GLI ISTONI Swi/Snf Rsc ISWIb Catalizzano lo scambio di H2A-H2B in maniera ATP-dipendente SWR1 Nuovo complesso SWR1 dedicato alla variante H2A.Z: Promuove esclusivamente lo scambio H2A.Z-H2B H2A-H2B Contiene molte subunità presenti anche nel complesso NuA4 (Act1, Arp4, Rvb1, Rvb2, God1, Vps72, Yaf9) SWR1(lievito) Tip60(mosca) NuA4 Swr1 Domino Tip60 HAT = Esa1

31 H2A.X H2A.X è una variante che fosforilata interviene nella riparazione dei danni al DNA. Riconosciuta dal complesso INO80 di lievito che contiene unATPasi simile a Swr1. Anche NuA4 e Tip60 (in mammifero e Drosophila) hanno un ruolo nel riparo di DSB e nel riconoscimento e/o eliminazione di H2A.X H2Av In Drosophlila, combina caratteristiche di H2A.Z e H2A.X nella regione C-terminale. Anche esso si trova nelle vicinanze dei siti DSB dTip60 acetila la forma H2Av (o nucleosomi che la contengono) e lo scambia con H2Av non fosforilato.


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