CINETICA DELLA CATALISI ENZIMATICA L’equazione più semplice capace di descrivere una reazione a un substrato e un prodotto catalizzata da un enzima sarà: k1 kcat E + S ES E + P k-1 In questa reazione di primo ordine la velocità di reazione, che corrisponde alla velocità di formazione del prodotto, è esprimibile come segue: V= Kcat ES Questa relazione ci indica che la velocità di formazione del prodotto è proporzionale attraverso la Kcat al complesso ES.

Se vogliamo esprimere questa equazione in termini di concentrazione di substrato e di enzima abbiamo bisogno di una nuova equazione che esprima la concentrazione di ES in funzione di queste due variabili.

L’ANALISI DI MICHAELIS-MENTEN E L’ANALISI DI BRIGGS-HALDANE Nella loro analisi Michaelis e Menten fecero l’assunzione che la Kcat della reazione enzimatica fosse molto bassa in rapporto alle velocità di formazione e di rissociazione del complesso ES. k1 kcat E + S ES E + P k-1 Questo significa che possiamo scrivere la costante di dissociazione in questo modo: Ks= E S/ ES= K-1/K1 L’assunzione è dunque che la Kcat sia trascurabile rispetto alle costanti di associazione e dissociazione del complesso ES.

L’equazione di Michaelis-Menten che si ottiene descrive matematicamente un’iperbole rettangolare: V= Kcat Et S / S  Ks Quando S>>Ks allora V=Vmax= Kcat Et per cui: Vmax S / S +Ks

L’equazione di Briggs-Haldane è formalmente identica a quella di Michaelis-Menten, la vera differenza sta nel fatto che nella costante globale di reazione ha un peso importante anche la costante catalitica di formazione del prodotto, la Kcat. Infatti, non è sempre vero che Kcat<<K1 o K-1 In questa situazione che cosa succede? dES/dt= K1ES - K-1ES - Kcat ES Formazione di ES Dissociazione di ES secondo due vie diverse

Allo stato stazionario avremo che dES/dt=0, cioè la velocità di formazione di ES è uguale alla sua velocità di dissociazione. L’equazione che otteniamo è: V= Kcat Et S / S  Km con Km = K-1 + Kcat/ K1 Km = Ks quando Kcat<<K-1

IL SIGNIFICATO DI Km E Kcat La costante di Michaelis Km è spesso definita come la costante di affinità con cui l’enzima lega il substrato. Infatti, quando Kcat<<K-1: Km = Ks = K-1/K1 k1 kcat E + S ES E + P k-1 quando Km>>1 allora l’enzima ha bassa affinità per S, poiché K-1 > K1 quando Km<<1 allora l’enzima ha alta affinità per S, poiché K1 > K-1 E’ vero però che Km può assumere valori >1 anche quando la Kcat assume valori elevati.

La costante Kcat rappresenta una vera e propria costante catalitica, infatti maggiore è il valore che assume e tanto più rapidi sono gli eventi catalitici al secondo; le dimensioni di Kcat sono infatti s-1 , ed è per questo che è anche detta numero di turnover. Kcat misura il numero di molecole di substrato trasformate da una molecola di enzima in un secondo. Quando la concentrazione di substrato è molto bassa possiamo dedurre altre informazioni sul significato di queste due costanti. Infatti, quando S<<Km la maggior parte dell’enzima è libera, per cui Et = E, per cui: V=Kcat E S/ Km

Il rapporto Kcat/Km può assumere un altro significato: In queste condizioni il rapporto Kcat/Km equivale ad una costante di velocità di secondo ordine per la reazione tra substrato ed enzima. Questo rapporto è una misura dell’efficienza e della specificità dell’enzima. In una soluzione in cui un enzima può attaccare due diversi substrati, sarà proprio il rapporto Kcat/Km per ognuno dei due substrati a guidare l’andamento della reazione. Il rapporto Kcat/Km può assumere un altro significato: k1 kcat E + S ES E + P k-1 Se poniamo che Kcat>>K-1, ossia che la velocità con cui l’enzima trasforma il substrato è talmente alta che la reazione sia praticamente irreversibile, allora la

reazione limitante dell’intero processo è costituita dalla costante K1, cioè dalla reazione dell’enzima col substrato. Infatti: Kcat = Kcat = K1 Km Kcat/K1 Un enzima mostrerà un’ alta efficienza catalitica quando avrà un valore del rapporto Kcat/Km compreso tra 108 e 109 (moli/L)-1 s-1.

Analisi e linearizzazione dell’equazione di Michaelis-Menten La linearizzazione dell’equazione ci permette di calcolare in maniera più accurata i valori di Km e Vmax per interpolazione dei punti sperimentali. Grafico dei doppi reciproci o di Lineweaver-Burk: Uno dei metodi più usati e quello di Lineweaver-Burk che usa la forma reciproca dell' equazione di Michaelis-Menten:

In questo caso interpolando i dati sperimentali di 1/V contro 1/S si ottiene una retta con: intercetta sull’asse delle y = 1/Vmax intercetta sull’asse delle x = -1/Km

Trasformazione di Eadie-Hofstee. Un altro modo di linearizzare l’equazione di Michaelis-Menten è quello di rimaneggiare l’eq. nel seguente modo:

SISTEMI DI INIBIZIONE ENZIMATICA A livello fisiologico l’attività di un enzima può essere regolata in maniera molto fine per fronteggiare le più svariate necessità. Ad es., un accumulo di Glc6P, il prodotto di reazione della prima tappa della glicolisi, è indice di eccesso di glucosio, cosicchè il Glc6Pfunziona da inibitore per la reazione stessa. Allo stesso modo un enzima può essere regolato positivamente in modo da aumentare la propria “performance catalitica” in caso di necessità immediate. Infine, esistono in natura sostanze alternative che possono mimare la struttura dei substrati naturali e che quindi possono legarsi impedendo la normale catalisi.

In particolare, esiste una distinzione tra inibizione reversibile e irreversibile. L’inibizione reversibile implica un legame non covalente dell’inibitore che quindi può essere rimossa allontanando l’inibitore stesso. Nell’inibizione irreversibile una molecola si lega covalentemente all’enzima inattivandolo.

Inibizione reversibile Competitiva: un substrato alternativo lega il sito attivo dell’enzima aumentando così la Km. Non competitiva: una molecola lega l’enzima sulla superficie dell’enzima determinandone un abbassamento della Kcat, senza modificare però le costanti di associazione tra substrato e prodotto. Incompetitiva: una molecola lega il complesso enzima substrato modificando sia Kcat sia Km.

Inibizione competitiva L’inibizione competitiva di un enzima avviene quando una molecola somigliante al substrato naturale è in grado di legarsi al sito attivo in modo da competere con la catalisi del substrato effettivo. Km app

In sostanza, la presenza dell’inibitore ha l’effetto di aumentare il valore della Km dell’enzima, cioè di diminuire in ultima analisi i siti liberi di catalisi dell’enzima per il suo substrato naturale. La presenza di I diminuisce la velocità di catalisi aumentando la Km (Kmapp). A concentrazioni elevate di S si raggiunge comunque la Vmax. Le intercette sull’asse delle y hanno lo stesso valore, infatti si può raggiungere Vmax anche con inibitore usando un largo eccesso di S. Il valore di -1/ Kmapp è più basso poiché Kmapp è più alto.

Allo stesso modo, se utilizziamo la forma di Eadie-Hofstee, l’equazione diventa:

Inibizione non competitiva L’inibizione non competitiva di un enzima avviene quando un substrato lega l’enzima sulla superficie determinandone un abbassamento della Kcat. -I +I In questo caso parliamo di Kcatapp o di Vmaxapp, in quanto è la Kcat ad essere modificata.

Inibizione incompetitiva L’inibitore incompetitivo è una sostanza che si lega al complesso ES dando origine al complesso non produttivo ESI. Tanto Vmax quanto Km sono diminuite dello stesso fattore [I]/1+ Ki

ENZIMI CON SITI CATALITICI MULTIPLI COOPERATIVI: ENZIMI ALLOSTERICI Quando un substrato che si lega ad un enzima induce dei cambiamenti strutturali tali da alterare le affinità dei siti vacanti si parla di cooperatività. Gli enzimi allosterici hanno appunto una risposta di tipo sigmoidale di fronte alle variazione della concentrazione di S.

Un parametro molto importante utilizzato per valutare il grado di sigmoidicità di una curva allosterica è il rapporto [ S0,9] / [ S01]. Nel caso della risposta iperbolica il rapporto [ S0,9] / [ S01] = 81. Per passare da un decimo della Vmax ai nove decimi della Vmax, la concentrazione di substrato deve incrementare di ben 81 volte. Nel caso della curva sigmoidale riportata in figura il rapporto [ S0,9] / [ S01] = 4,4. In questo caso è sufficiente un incremento molto minore della concentrazione del substrato per passare da Vmax = 0,1 a Vmax = 0,9. In altri termini la risposta sigmoídale agisce come un interruttore e a valori intermedi di velocità l’enzima appare più sensibile a variazioni di [S]. Sono stati proposti due modelli per spiegare il comportamento allosterico degli enzimi: Il modello ad interazione sequenziale-KNF Il modello a simmetria concertata

Il modello di Koshland-Nmethy-Filmer (KNF) si basa su due ipotesi principali: 1.) in assenza di ligandi, la proteina allosterica esiste in una sola conformazione. 2.) Il legame del ligando ad una sottounità produce un cambiamento conformazionale alla sottounità stessa. Tale cambiamento altera a sua volta la conformazione delle sottounità libere adiacenti. Questo cambiamento si traduce sostanzialmente in una maggiore o minore affinità dei siti liberi per le nuove molecole di substrato. In questo caso il legame al dimero di una molecola di substrato provoca una modificazione della costante di dissociazione intrinseca Ks di un fattore a.

Questa equazione considera che le variazioni allosteriche modificano le costanti di affinità per il legame con i substrati successivi senza alterare le Kcat. a<1 Coop. + Michaelis-Menten a>1 Coop. - Influenza del fattore di interazione a sulla cooperatività in un dimero.

Effetto cooperativo sulla Vmax. Nel caso in cui il legame del substrato non provochi alcuna modificazione di affinità dei siti vacanti, ma provochi invece una modificazione delle costanti cinetiche dei siti plurioccupati si ha un effetto di cooperazione sulla Vmax. La costante di dissociazione intrinseca Ks dei complessi ES (o SE) è uguale a quella del complesso SES, ma la costante cinetica intrinseca per la formazione del prodotto è d volte quella del complesso ES o SE.

Per valori di d > 1 la curva di velocità è sigmoidale Per valori di d > 1 la curva di velocità è sigmoidale. Ciò è comprensibile considerando che a basse concentrazioni di substrato la velocità osservata è quella dovuta all'attività dei soli complessi ES e SE ( aventi una costante di formazione del prodotto uguale a kp, mentre a concentrazioni elevate di substrato sono presenti essenzialmente i complessi SES, molto più produttivi, in quanto dkp> kp. Per valori di d < 1, quando cioè il complesso SES ha una costante cinetica di formazione del prodotto dkp inferiore a quella dei complessi ES e SE ( dkp < kp ) la curva non è una sigmoide : a basse concentrazioni di substrato l' enzima lavora a velocità più elevate della Vmax e presenta una marcata inibizione da eccesso di substrato. Anche in questo caso anche se la cinetica non è di tipo sigmoidale il rapporto [ S ]0,9 / [ S ]0,1 è < 81.

IL MODELLO A SIMMETRIA CONCERTATA- MWC 1.) le proteine allosteriche sono degli oligomeri formati da sottounità (monomeri) identiche, disposte in modo simmetrico. 2.) Ogni monomero possiede un unico sito di legame per ogni ligando (uno per il substrato, uno per ogni eventuale inibitore ed uno per ogni eventuale attivatore). 3.) L'oligomero è presente, in assenza di qualsiasi ligando, in due conformazioni tra loro in equilibrio: 4.) L'affinità di un sito di legame per un dato ligando dipende dalla configurazione dell'oligomero. Alcuni ligandi preferiscono legarsi alla forma RO altri alla forma TO. Il l substrato si lega preferenzialmente alla forma RO secondo l' equazione: COSTANTE ALLOSTERICA DELL’EQUILIBRIO

La costante intrinseca di dissociazione del complesso TS è in questo caso indicata come KT ed è sempre maggiore (o al massimo eguale) della KR. Il rapporto KR / KT = c coefficiente di legame non-esclusivo, assume valori compresi tra 0 e 1. con

Si può dimostrare che per un enzima con n sottounità, l' equazione generale di velocità secondo il modello MWC è la seguente: