ANALISI CITOFLUORIMETRICA E SUE APPLICAZIONI IN AMBITO BIOMEDICO

Definizione CITOFLUORIMETRIA o CITOMETRIA A FLUSSO Metodica di laboratorio che permette un’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse misurando le caratteristiche citologiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca una sorgente luminosa, acquisendo e memorizzando piu’ parametri (volume, granulosita’, fluorescenza) per ogni cellula acquisita

Principi di funzionamento Sistema fluidico (focalizzazione idrodinamica) Sistema ottico (laser Argon 488nm) Sistema elettronico (software CellQuest)

Sistema Fluidico

Sistema Ottico

Sistema Elettronico

Parametri LIGHT SCATTERING (Forward and Side Scatter) FLUORESCENZA (FITC, PE, PerCP, Cy5.5, Alexa, Biotina, PI, APC, ...)

Light Scattering Sangue periferico

Fluorescenza Plot FITC/PE/Per CP IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA Plot FITC/PE/Per CP Intensita’ F proporzionale ai siti di legame

Marcatori(linfocitari): la nomenclatura CD Si considera membro di un Cluster differentiation un Marcatore di superficie che: identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo ha una struttura biochimica definita è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

Informazioni aggiornate www.courseware.vt.edu/users/kdelgert/ (www.bsi.vt.edu/immunology) www.ncbi.nlm.nih.gov/prow

Applicazioni determinazione dei marcatori di differenziamento cellulare, di superficie, intracitoplasmatici e intranucleari valutazione del contenuto cellulare di DNA discriminazione tra cellule vive, cellule apoptotiche e necrotiche predisposizione per la separazione cellulare

e malattia residua minima Immunofenotipo Permette di IDENTIFICARE,NUMERARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti in caso di antigenti specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima

Marcatori B-lineage TdT CD79a CD19 CD10 CD20 CD22 Cu SmIg

Marcatori T-lineage CD7 CD2 CD5 CD3 CD1 CD4 CD8 TdT TCR

Marcatori granulocitopoiesi CD34 CD13 CD33 CD117 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15

Marcatori monocitopoiesi CD34 CD13 CD33 CD14 CD11b CD16 CD66b CD66c CD15

Marcatori eritrocitopoiesi CD34 CD45 CD33 CD71 CD105 CD36 GPA

Gating CD 45 ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCICITI PERIFERICI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

Espressione CD45 Linfociti Monociti Granulociti maturi Cellule immature Granulociti immaturi Eritrociti

Scelta degli antigeni e Criteri di Positività ALTA SENSIBILITA’ (es.CD19 nelle ALL-B) ALTA SPECIFICITA’ (es.CD34, CD133) Positività?

ALL-T

ALL-T CD1a, CD2, CD3, cyCD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TdT ,(CD34)

ALL-B, common

ALL-B, common CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT, (CD15)

ALL-B, B matura

CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT ALL-B, B matura CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD34, DR, IgM, cyIgM, Kappa, lambda, TdT

LAP

LAP MPO, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, DR, CD41, CD56, CD61 (CD2)

G+15 dopo terapia con ATRA LAP G+15 dopo terapia con ATRA ESORDIO:popolazione blastica G+15:popolazione matura

LAM

Midollo osseo, liquido cefalorachidiano BM liquor

Midollo osseo, sangue periferico, liquido cefalorachidiano BM PB liquor

Neuroblastoma

Ciclo cellulare e apoptosi DATI RICERCA Differenziamento Pession et al., MLL-AF9 oncogene expression affects cell growth but not terminal differentiation and is downregulated during monocyte-macrophage maturation in AML-M5 THP-1 cells, Oncogene. 2003 Nov 27;22(54):8671-6. Ciclo cellulare e apoptosi Pession et al., Targeted inhibition of NMYC by peptide nucleic acid in N-myc amplified human neuroblastoma cells: cell-cycle inhibition with induction of neuronal cell differentiation and apoptosis, Int J Oncol. 2004 Feb;24(2):265-72.

VANTAGGI dell’ANALISI citofluorimetrica : multiparametricità possibilità di mettere in relazione più caratteristiche della stessa cellula analisi di grandi quantità di cellule riproducibilità ed affidabilità statistica delle acquisizioni grande sensibilità rapidità di analisi possibilità di ulteriori analisi a posteriori

Conclusioni La citofluorimetria completa il repertorio della diagnosi emato-oncologica : Identifica la malattia residua minima Distingue la ripresa di malattia VS da iperproduzione del midollo Determina la presenza di malattia disseminata (ALL latente, santuari exramidollari)