METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse. campione + complesso antigene-anticorpo anticorpo quantificazione del complesso antigene-anticorpo

LA NASCITA DEI METODI IMMUNOMETRICI 1942. Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluoresceina. 1959. Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1977. 1960. Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche. 1969. Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide. 1969. Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA). 1971. Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida. 1972. Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT). 1975. Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1984.

VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) ANALISI DIRETTA Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti) OMOGENEIZZAZIONE ESTRAZIONE ANALISI

VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)  Piccoli volumi di campione  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi)  Diagnosi precoce  Determinazione di sostanze in tracce

VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno

VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche - errori precisione e accuratezza - tempi di esecuzione rapidità

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI Il legame tra antigene (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: Ab An + An-Ab ka kd Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = dove An-Ab è il complesso antigene-anticorpo, ka e kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio Un anticorpo adatto per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una Keq = 109-1012 M-1

COME SI OTTIENE UN ANTICORPO Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è un antigene in grado di stimolare una risposta immunitaria solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. Mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi policlonali, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. È anche possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo.

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II) IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI Vantaggi Svantaggi Caratteristiche (affinità e specificità) note e costanti Spesso caratterizzati da bassa affinità Solitamente caratterizzati da elevata specificità Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene) E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata Non sempre reagiscono con la proteina A Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione Tecniche di produzione più sofisticate

ANTIGENI ED APTENI braccio spaziatore aptene carrier Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier” (es. BSA o KLH) che ne aumenta la massa complessiva. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene. anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore anticorpi che riconoscono il carrier anticorpi che riconoscono l’aptene

SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). La tendenza dell’anticorpo a legare altre molecole, strutturalmente simili all’analita, viene quantificata attraverso la sua reattività crociata. Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici BaP 100% 40% posizione di coniugazione con la proteina carrier utilizzata per la sintesi dell’immunogeno

STRATEGIE DI SINTESI DELL’IMMUNOGENO La scelta della posizione di funzionalizzazione usata per la sintesi dell’immunogeno permette di ottenere anticorpi per diverse applicazioni immunogeno immunogeno Anticorpo specifico per l’analita Anticorpo specifico per la classe

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: Ab An + An-Ab ka kd Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd =

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq SCATCHARD PLOT (I) L’affinità dell’anticorpo per l’analita può essere determinata graficamente mediante diagramma di Scatchard. Riprendendo l’equazione: Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = si definisce Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq (concentrazione totale di anticorpo). Riarrangiando l’equazione ed introducendo Abt si ottiene: [An-Ab]eq [An]eq = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq SCATCHARD PLOT (II) [An-Ab]eq [An]eq = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, dove la pendenza è – Keq, l’intercetta sull’asse y è KeqAbt e l’intercetta sull’asse x è Abt.

SCATCHARD PLOT (III) Keq High affinity Abt Low affinity

EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO SCATCHARD PLOT (IV) EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO [An-Ab] [An-Ab]/[An] Retta 1 Retta 2 Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla Keq massima ed alla Keq minima. La Keq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo: eterogeneità (differenza tra le due Keq); specificità (gli anticorpi con Keq vicina alla Keq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto).

TRACCIANTI An + Ab An-Ab La formazione del complesso An-Ab non è in genere facilmente misurabile. Viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto (non viene infatti rivelato direttamente l’analita) introducendo un tracciante che partecipando alla reazione immunologica la evidenzia con alta rivelabilità. Il tracciante viene ottenuto legando un “label” opportuno (specie facilmente rivelabile con una opportuna tecnica analitica) all’antigene, ad un derivato dell’antigene o ad un anticorpo.

LABEL Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di rivelazione del metodo. Isotopi radioattivi (125I, 3H) Molecole fluorescenti - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati - cromogenici - fluorescenti - chemiluminescenti

Tracciante: limite di rivelazione SCELTA DEL LABEL Tracciante: limite di rivelazione Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa (10-12-10-20 g) e facilmente rivelabile TRACCIANTE SEGNALE MASSA (moli/tubo) 125I ≈ 10.000 dpm 0.1 – 10 x 10-15 Enzima Assorbanza 10-15 – 10-16 Luminescenza 10-16 – 10-18 Fluorescenza 10-15 – 10-18 Amplificazione ciclica enzimatica 10-20 – 10-21 Molecola fluorescente I fluorescenza 10-18 – 10-19 Molecola chemiluminescente mV

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) Vantaggi relativi all’uso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi all’uso di enzimi: l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

TRACCIANTI ENZIMATICI SISTEMA DI RIVELAZIONE METODOLOGIA ANALITICA Perossidasi H2O2/cromogeno Spettrofotometria H2O2/luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria AMPPD Chemiluminescenza -galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone Fluorimetria 2-naphthyl--D-galactopyranoside Chemiluminescenza La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO (DELFIA) Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della fluorescenza lunghi (10-100 ms) Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA Può essere considerata una chemiluminescenza attivata per via elettrochimica anziché chimica. Ru(bpy)32+ electrode TPA Ru(bpy)32+: ECL label TPA: tripropylamine products photon Ru(bpy)32+* Ru(bpy)33+ e- TPA+ TPA● - H+

CHEMILUMINESCENZA ELETTROGENERATA VANTAGGI: E’ una reazione ciclica e quindi può essere considerata un sistema amplificato Può essere “accesa” e “spenta” (la reazione avviene solo se avviata elettrochimicamente) Non ha segnale di fondo Per questi motivi è abbastanza diffusa nei sistemi automatizzati di analisi clinica (uno dei sistemi attualmente in commercio combina la chemiluminescenza elettrogenerata con l’usi di supporti magnetici sui quali sono immobilizzati gli anticorpi per attuare metodi immunimetrici eterogenei con rivelazione chemiluminescente)

METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (IV) Analizzatore Elecsys, prodotto dalla Roche Elettrodi per la produzione del segnale ECL magnete Fasi di reazione e lavaggio: microsfere in sospensione Fasi di eliminazione della soluzione: microsfere trattenute dal magnete

METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (V) Sono a tutt’oggi disponibili oltre 50 metodi immunometrici per sistemi Elecsys:

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI COMPETITIVI ETEROGENEI COMPETITIVI OMOGENEI NON COMPETITIVI ETEROGENEI NON COMPETITIVI OMOGENEI

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). L’equilibrio che si instaura è: KAn An + Ab An-Ab Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*]i = costante [Ab]i = costante [Ab]i < [An]i + [An*]i + An* KAn* An*-Ab

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita segnale log concentrazione analita log [analita]

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione della lettura del campione incognito su di una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B0 in funzione del logaritmo della concentrazione di analita. B/B0 log concentrazione analita B0 è il segnale ottenuto in assenza di analita B è il segnale a concentrazione x di analita

PARAMETRI QUANTITATIVI Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard di B0 Sensibilità pendenza della curva Midrange Concentrazione corrispondente a B/B0 50% B/B0 log concentrazione analita Intervallo dinamico Convenzionalmente compreso fra B/B0 90% e B/B0 10%

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI “FITTING” DELLA CURVA DI CALIBRAZIONE y x b = fattore di pendenza(*) FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI x = dose y = B-N FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI a c a+d 2 y x d b = fattore di pendenza(*) L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N x = dose y = B (*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log

PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE SI ASSUME ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%) errori

EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI B/B0 log concentrazione analita Riduzione del limite di rivelazione: Ridurre la concentrazione del tracciante Diminuire la quantità di anticorpo immobilizzato e riottimizzare il metodo (se la rivelabilità del tracciante è adeguatamente elevata, si sposta verso il basso il range dinamico) Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo e riottimizzare il metodo La rivelabilità assoluta del tracciante ha un effetto solo indiretto, permettendo di lavorare a concentrazioni minori.

SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO La specificità di un anticorpo è la sua capacità di discriminare tra antigeni con struttura simile. Tra i vari modi per misurare la specificità di un anticorpo, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto. 100 [An-Ab]/[An] 50 a b [An]

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose-risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva.

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO Sono commercialmente disponibili numerosissimi kit per analisi immunometrica, tipicamente con rivelazione colorimetrica, che permettono anche a laboratori piccoli e relativamente poco attrezzati di sfruttare i vantaggi di queste tecniche utilizzando strumentazione poco costosa.

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO Quanto costa un’analisi immunometrica? - Kit immunometrico per analisi del progesterone: 80 € (permette di effettuare 40 analisi in duplicato → 2 €/analisi) - Spettrofotometro per micropiastre con filtri per le adeguate lunghezze d’onda: 7500-10000 € - Altra attrezzatura indispensabile per l’analisi (micropipette, vortex, ecc.): 2000-3000 € - Materiali “disposable” (provette, puntali, ecc.): 10-20 € per ogni kit utilizzato - Tempo richiesto per l’analisi, includendo i tempi necessari per la preparazione dei campioni ed i tempi di incubazione: 3-4 ore per 40 campioni

METODI COMPETITIVI OMOGENEI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo.

METODI COMPETITIVI OMOGENEI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) Sono stati proposti due sistemi. 1° sistema: Il tracciante in soluzione è attivo Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

METODI COMPETITIVI OMOGENEI EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) 2° sistema: Il tracciante in soluzione è inattivo Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

METODI COMPETITIVI OMOGENEI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola. Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, il piano di polarizzazione della luce emessa sarà parallelo a quello della luce assorbita. luce assorbita luce emessa fluoroforo

METODI COMPETITIVI OMOGENEI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato ( ) e dal movimento rotatorio della molecola. Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione. fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare La polarizzazione viene mantenuta La polarizzazione viene persa

METODI COMPETITIVI OMOGENEI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di movimento di circa 10-100 ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 0,1-1 ns. In condizioni di eccitazione costanti l’emissione polarizzata sarà funzione delle dimensioni del fluoroforo e del rapporto tra tempo di rilassamento rotazionale e tempo di decadimento della fluorescenza. L’analita è marcato con una molecola fluorescente. Mediante misure di FP è possibile misurare la frazione di tracciante legato all’anticorpo in fase omogenea. Infatti il tracciante legato mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Perché ciò si verifichi, il tempo di decadimento della fluorescenza deve essere più lungo del tempo di rotazione del farmaco e più breve del tempo di rotazione del complesso antigene-anticorpo.

METODI IMMUNOMETRICI NON COMPETITIVI Non Competitivi di Tipo “Sandwich”: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*) [Ab] > [Ag] [Ab*] > [Ag] L’analita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Antigene Enzima Incubazione Tracciante Anticorpo di rivelazione Aggiunta del tracciante Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) DIRETTI INDIRETTI

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO + + Ab anti-ferritina marcato con HRP Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo 60 min 37 °C + 30 min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione

Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO CARATTERISTICHE DEL METODO Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Anticorpo Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Anticorpo specie-specifico Incubazione Substrato enzimatico Lavaggio Antigene di cattura immobilizzato Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

STRATEGIE DI RIVELAZIONE DI UN ANTICORPO Marcatura diretta Ab anti-specie X marcato Rivelazione mediante un anticorpo secondario marcato Ab ottenuto nella specie X Streptavidina marcata Ab anti-specie X biotinilato Rivelazione mediante un anticorpo secondario rivelabile con un opportuno reagente Ab ottenuto nella specie X

COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA IMMUNODOSAGGI MEDIANTE IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA biotina avidina enzima MARCATURA CON IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA TECNICA DEL PONTE AVIDINA-BIOTINA

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva ideale è lineare. Segnale Concentrazione analita In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione. Segnale Concentrazione analita aspecifico saturazione

PARAMETRI QUANTITATIVI Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard del bianco Segnale Sensibilità pendenza della curva concentrazione analita Intervallo dinamico

EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI B/B0 concentrazione analita Riduzione del limite di rivelazione: Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo (l’antigene viene catturato più efficacemente dell’anticorpo) Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa) ottimizzando le condizioni di rivelazione, utilizzando principi di rivelazione maggiormente sensibili o sistemi di rivelazione amplificati.

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI substrato prodotto intermedio prodotto finale Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi). Solo quando i due anticorpi sono legati all’antigene gli enzimi sono sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale. In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence resonance energy trasfer), ecc...

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI SISTEMA INDICATORI i1/i2 SUBSTRATI PRODOTTI P1/ P1 Enzimi vicinali Esochinasi/ GPDasi ATP/glucosio NAD+ Glucosio 6-fpsfato Gluconolattone-6-fosfato + NADH GOasi/ POasi Glucosio/ Donatore H ossidato Perossido/

METODI OMOGENEI NON COMPETITIVI Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Analita di grandi dimensioni: metodo non competitivo con tracciante=anticorpo marcato (meno utilizzato) anticorpo analita marcato (in eccesso) bassa %P alta %P %P [analita]

METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI CARATTERISTICHE Metodi eterogenei Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei

ESEMPI DI TEST COMPETITIVI E NON COMPETITIVI Tecnica Range Tempi analisi FT4 Competizione 0-7 ng/ml 90’ T3 0-6 ng/ml 60’ T4 0.25µg/dl Ig-E Sandwich 0-500 IU/mL 180’ Prolattina 0-400 ng/ml FSH 0-150 mIU/ml 150’ Cortisolo 0-50 µg/dl

INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc; la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO (DELFIA) Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della fluorescenza lunghi (10-100 ms) Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

APPLICAZIONI: ESEMPI Le più comuni applicazioni dei metodi immunometrici in chimica analitica clinica riguardano la determinazione di: ormoni nei fluidi biologici (sangue, urina, saliva) farmaci nel siero e nelle urine (antiepilettici, antidepressivi, cardioattivi, immunosoppressivi, antibiotici, ecc...) droghe d’abuso nei fluidi biologici (oppiacei, allucinogeni, cannabinoidi, cocaine) Immunoglobuline nel sangue, IgE e allergeni vari e IgD nel siero, proteine di derivazione tubulare e glomerulare nelle urine Interleuchine diagnosi di Helicobacter pylori, Herpes, Rubella, Brucella, Toxoplasma, Epatite

SENSIBILITA’ DEI METODI IMMUNOMETRICI

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay Negativo Positivo Permettono un’analisi qualitativa o semi-quantitativa molto rapida: Il campione viene aggiunto ad una estremità (S) e fluisce lungo la membrana per effetto di capillarità, Successivamente, si raggiunge la zona di cattura dell’analita (T) e la zona di controllo (C)

LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura:    - da negativo a 20 mg/l    - da 20 a 50 mg/l    - da 50 a 100 mg/l    - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test:    - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l    - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l    - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l    - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza:    - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante    - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO 9002 Conformità direttiva 98/79/CEE

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: analizzatori automatici Abbott TDx Laboratori di grosse dimensioni utilizzano analizzatori automatici che, una volta inserito il campione, eseguono automaticamente le procedure di calibrazione, analisi del campione ed elaborazione dei dati.

METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE In opportune condizioni la formazione del complesso antigene-anticorpo dà luogo ad una reazione di precipitazione: essendo le molecole di anticorpo bivalenti e possedendo spesso l’antigene due o più epitopi, si ottengono comunemente precipitati con legami reticolati (cross-linked). In un sistema ideale abbiamo tre zone: (A) Eccesso di anticorpo (Ab) -(B) Zona di equivalenza (zona più interessante a fini analitici). -(C) Eccesso di Ag Ab precipitato A B C Ag

METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE La “composizione” del precipitato varia fortemente nelle tre zone. La precipitazione degli aggregati antigene-anticorpo (reazione di immunoprecipitazione) rappresenta una tecnica molto utilizzata per l’analisi qualitativa e quantitativa di componenti relativamente abbondanti nel siero, in particolare delle proteine sieriche. Nell’ambito delle tecniche basate su reazioni di immunoprecipitazione abbiamo: -Tecniche basate sulla diffusione -Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida -Tecniche di tipo elettroforetico In senso lato, anche le tecniche immunometriche propriamente dette (es. tecniche immunoenzimatiche) si possono considerare tecniche di immunoprecipitazione. Ab precipitato A B C Ag

METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI Tecniche di diffusione monodimensionale Diffusione monodimensionale semplice: la soluzione contenente (potenzialmente) l’antigene in esame viene stratificata sopra un gel di agar contenente un opportuno antisiero. L’antigene migra nel gel, determinando la formazione di una o più bande di “precipitato” (complesso antigene-anticorpo) nelle zone ove si raggiungono rapporti ottimali di concentrazione (poiché queste zona variano nel tempo, le bande migrano verso il basso). Diffusione monodimensionale doppia: fra le due soluzioni viene interposto un ulteriore stato di gel di agar (“zona neutra”). Le bande si formano quindi dove la diffusione di entrambe le specie porta al raggiungimento dei rapporti ottimali di concentrazione antigene/anticorpo. Soluzione contenente l’antigene Diffusione Gel di agar contenente l’antisiero Zona neutra Diffusione

METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI Tecniche di diffusione bidimensionale Soluzione contenente l’anticorpo Soluzioni contenente l’antigene Nelle tecniche di diffusione bidimensionale si utilizza uno strato di gel di agar, nel quale sono stati ricavati pozzetti nei quali vengono poste le soluzioni in esame e la soluzione di anticorpo. A seguito della diffusione radiale dei vari componenti, ove possibile si formano “archi” di precipitato che identificano l’avvenimento della reazione antigene-anticorpo. Con opportune modificazioni questa tecnica è applicabile anche a fini quantitativi (es. tecniche di immunodiffusione radiale: usando solo l’antigene nei pozzetti, mentre l’anticorpo è disciolto nel gel di agar, l’area delle bande che si formano è proporzionale alla concentrazione dell’antigene). Reazione antigene-anticorpo Nessuna reazione Diffusione

METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida Nelle tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida il precipitato formatosi a seguito della reazione antigene-anticorpo viene di solito quantificato attraverso l’effetto Tyndall, ovvero la dispersione della luce incidente. La quantificazione del precipitato può avvenire mediante turbidimetria o nefelometria (la seconda è nettamente più sensibile, permettendo di raggiungere limiti di rivelazione nettamente minori di quelli ottenibili con le tecniche di diffusione). Misura della luce “assorbita”: turbidimetria Luce incidente Misura della luce diffusa: nefelometria

Rivelazione USO DI PARTICELLE DI POLISTIRENE PER METODI IMMUNOMETRICI (es:PACIA - Particle Counting Immunoassay o misure di diffusione) Rivelazione