Citometria a flusso La citometria a flusso è una metodica per l’analisi e caratterizzazione di particelle microniche, soprattutto di origine biologica. Una sospensione di particelle (ad esempio cellule) viene convogliata da un sistema fluidico laminare di trasporto in un capillare fino al punto di misura.

Principio di funzionamento Un fascio luminoso focalizzato intercetta il flusso di particelle e vengono generati segnali dall’incontro di ogni singola particella con la radiazione elettromagnetica. I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi trasduttori che li convertono in segnali elettrici. Questi segnali elettrici vengono amplificati ed elaborati da un analizzatore che provvede alla rappresentazione grafica e all’analisi statistica.

Schema di un citometro a flusso capillare fotomoltiplicatore software raggio  Sorgente luminosa particella

Sistema fluidico Il sistema fluidico è di fondamentale importanza in quanto può influenzare il segnale letto dal rilevatore. Poiché il citofluorimetro rilevi una ad una le particelle presenti nel campione di partenza in maniera omogenea è necessario che lo strumento sia dotato di un sistema che immetta nel capillare ogni singola particella nello stesso punto.

Flusso laminare E’ necessario che nel capillare si instauri un flusso laminare (non turbolento). In condizioni di flusso laminare le forze di inerzia idrodinamica esercitate sulle particelle le mantengono durante il loro moto al centro del capillare (idrofocalizzazione del flusso).

Flusso laminare/2 flusso interno particella flusso esterno In tali condizioni di flusso si possono considerare due regimi fluidici coassiali: quello interno (core flow) contiene le particelle, quello esterno (sheat flow) mantiene queste ultime lungo l’asse ideale di flusso. flusso interno particella flusso esterno

Flusso laminare/3 Agendo sul sistema pneumatico di trasporto che controlla la differenza di velocità tra il flusso interno e flusso esterno si regola la velocità di flusso delle particelle all’interno del capillare per ottenere segnali per singole particelle.

Tipi di segnale I segnali originati sono solitamente di tre tipi: Diffusione a basso angolo (Forward scatter) Diffusione a 90° (Side scatter) Fluorescenza Tali segnali sono quindi legati alle caratteristiche fisiche della particella e alla eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in esse.

(intensità dipendente dalle dimensioni della particella) Forward Scatter fotomoltiplicatore raggio particella raggi diffratti (intensità dipendente dalle dimensioni della particella)

Forward Scatter/2 Il segnale di Forward Scatter non dipende solo dalle dimensioni delle cellule, ma anche dalla posizione della particella nel capillare quando il laser colpirà la particella A Particelle delle medesime dimensioni che generano due segnali di Forward Scatter differenti B A B

Side Scatter Il Side Scatter è in relazione con le caratteristiche superficiali della particella in quanto il segnale è in relazione allo scattering della luce incidente da parte della superficie della particella. FS SS

Sorgenti luminose La citometria a flusso è in larga parte utilizzata per la caratterizzazione di cellule intere. In questi casi la sorgente utilizzata è laser ad Argon, di potenza tra i 15 mW e 5 W, centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu). La sorgente al laser Ar possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l’ eccitazione di numerosi fluorofori.

Sorgenti al laser La sorgente ad Ar ha un costo relativamente elevato e permette l’emissione ad un ridotto numero di lunghezze d’onda: 514, 488 e 345 nm. Altri tipi di sorgenti laser a  differenti sono impiegate in citometria a flusso: Kripton Elio Neon

Altre sorgenti Una sorgente di radiazione più economica e policromatica è la lampada a vapori di mercurio. Tale sorgente ha questi svantaggi per l’impiego in citometria a flusso: radiazione poco potente scarsa stabilità nella luce di emissione sistemi elettronici di compensazione rapido decadimento

Citometria a flusso di cellule Segnali legati alle caratteristiche cellulari: SS FS Volume (diametro) o dimensioni Rapporto nucleo/citoplasma Granulosità interna Rugosità di membrana Fluorescenza Presenza di marcatori di superficie Indicatori di attività enzimatica intracellulare Indicatori di vitalità

Cella del citometro a flusso Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid Coulter Cytometry

Tipi di immunofluorescenza per FC La fluorescenza è ottenuta mediante il legame di uno o più anticorpi marcati con un fluorocromo ad uno o più antigeni di membrana. Queste tecniche vengono definite “tecniche di immunofluorescenza diretta e indiretta” DIRETTA INDIRETTA singola doppia tripla

Ottica a tripla fluorescenza PMT 4 Filtri dicroici PMT 3 Cella a flusso PMT 2 Filtri a banda passante PMT 1 Laser Coulter Cytometry

Analisi dei dati Dalla combinazione dei due tipi di segnali si ottiene un particolare diagramma bidimensionale detto “citogramma a dot–plot” In un citogramma ogni punto rappresenta un evento contato, dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati. I citogrammi mettono in relazione correlazione 2 differenti parametri rilevati, solitamente 2 tipi di fluorescenza oppure una fluorescenza ed uno scattering (FS o SS)

Fluorescence detector Citometro a flusso come selettore cellulare 488 nm laser FS Sensor Fluorescence detector - + Charged Plates And then about the cell sorting. In cell sorting, we can chose what are the properties of the cells what we what to sort. Here we can charge the drop based on these properties and then the drop can be separated using charged plates. In one drop there are one cell so single cells can be sorted. Single cells sorted into test tubes

Citofluorimetro analizzatore Coulter Cytometry

Citofluorimetro selezionatore cellulare Coulter Cytometry