POLIMORFISMI DEL DNA Il polimorfismo rs7799039 della Leptina UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI GENOVA GENETICA MOLECOLARE IRCCS GASLINI

POLIMORFISMO = esistenza di forme diverse è definito polimorfico un locus per il quale esistono più alleli, ciascuno dei quali è presente in una determinata popolazione con una frequenza maggiore di quella attesa in base a mutazione ricorrente. POLIMORFISMO PROTEICO variabilità genetica POLIMORFISMO DEL DNA

Il polimorfismo del DNA Per convenzione se l’allele meno frequente ha, nella popolazione, una frequenza: Superiore all’1% si parla di locus polimorfico Inferiore all’1% si parla di variante rara ( come la maggior parte delle mutazioni deleterie che causano malattie genetiche) La differenza tra due individui, in media, è di 1 ogni 1000 nucleotidi. In una popolazione esiste quindi grande diversità genetica. unicità genetica di ciascun individuo

TIPI DI POLIMORFISMI DEL DNA RESTRICTION FRAGMENTS LENGHT POLYMORPHISM ( RFLP) 2. SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM ( SNP ) 3. VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS (VNTR)

POLIMORFISMI DI LUNGHEZZA DEI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE ( RFLP, Restriction Fragment Lenght Polymorphisms ) A seguito di una mutazione si determina l’abolizione o la creazione di un sito di restrizione per un enzima di restrizione, con conseguente variazione (polimorfismo) nella lunghezza dei frammenti di restrizione per un dato enzima di restrizione. Sono polimorfismi di un singolo locus e biallelici. Le differenze nella sequenza del DNA che si rilevano attraverso la diversa lunghezza dei frammenti di restrizione, possono essere equiparate ad alleli codominanti di un locus mendeliano: la presenza o assenza di uno o dell’altro allele può venire riconosciuta in ogni individuo e gli individui omozigoti possono essere distinti dagli eterozigoti. Sono comuni nelle regioni non codificanti del DNA.

POLIMORFISMI DI SINGOLI NUCLEOTIDI ( SNP, Single Nucleotide Polymorphisms ) Sono variazioni di singole coppie di basi nel genoma, es. in una determinata posizione vi è una T e in un altro individuo nella stessa popolazione vi è una C. Alcuni RFLP sono causati da SNPs, anche se non tutti gli SNPs coinvolgono siti di restrizione. Sono polimorfismi biallelici Sono presenti in numero elevato nel genoma umano, almeno 3 milioni sono utili marcatori genetici

3. POLIMORFISMI DI RIPETIZIONE (VNTR, Variable Number Tandem Repeats) Il sito di restrizione viene lasciato intatto, ma la lunghezza del frammento di restrizione varia a seconda del numero di ripetizioni in tandem, testa-coda, tra i due siti di restrizione posti alle due estremità. Si distinguono in : - minisatelliti ( ripetizioni di qualche decina di basi) - microsatelliti (ripetizioni di 2,3,4 basi,tipo (AC), (CAG), (AAAT), Si identificano mediante PCR Sono polimorfismi multiallelici,essendo molto variabile il numero di ripetizioni È molto probabile che due individui non imparentati abbiano genotipi diversi utili in medicina legale

Struttura del gene ob umano Dal SITO NCBI : Official Symbol LEP and Name: leptin [Homo sapiens] Chromosome: 7; Location: 7q31.3 This gene encodes a protein that is secreted by white adipocytes, and which plays a major role in the regulation of body weight. This protein, which acts through the leptin receptor, functions as part of a signaling pathway that can inhibit food intake and/or regulate energy expenditure to maintain constancy of the adipose mass. This protein also has several endocrine functions, and is involved in the regulation of immune and inflammatory responses, hematopoiesis, angiogenesis and wound healing. Mutations in this gene and/or its regulatory regions cause severe obesity, and morbid obesity with hypogonadism. This gene has also been linked to type 2 diabetes mellitus development.

Struttura del gene ob umano 5’ 3’ Esone 1 Esone 2 Esone 3 cDNA ob Sequenza codificante 504 pb Poly(A) ATG TGA Il gene ob umano è composto di 3 esoni separati da 2 introni Esone 1 (1-29) viene trascritto, ma non tradotto Esone 2 (172 pb) viene trascritto tutto, ma viene tradotto solo in parte -Esone 3 (3225 pb) viene trascritto tutto,ma tradotto solo in parte

Regolazione della trascrizione sito d’inizio della trascrizione PROMOTORE +1 gene ob ATG -2548 enhancer GT 5’UTR POLIMORFISMO Rs 7799039 ESONE 1 introne ESONE 2 introne ESONE 3 3’UTR trascrizione Precursore dell’mRNA 29 172 3225 Splicing RNA maturo Nella regione del promotore,di lunghezza variabile,si trova una serie di brevi sequenze che vengono riconosciute e legate da fattori di trascrizione. Accanto a sequenze comuni a molti promotori vi sono elementi che sono riconosciuti da fattori di trascrizione tessuto-specifici

RNAm trascritto dal gene ob ( 1-163519 ) GTAGGAATCGCAGCGCCAACGGTTGCAAG GCCCAAGAAGCCCATCCTGGGAAGGAAAATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTCCAAGCTGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACG CAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGAGGCCTTGAAGGTCACTCTTCCTGCAAGGACTACGTTAAGGGAAGGAACTCTGGCTTCCAGGTATCTCCAGGATTGAAGAGCATTGCATGGACACCCCTTATCCAGGACTCTGTCAATTTCCCTGACTCCTCTAAGCCACTCTTCCAAAGGCATAAGACCCTAAGCCTCCTTTTGCTTGAAACCAAAGATATATACACAGGATCCTATTCTCACCAGGAAGGGGGTCCACCCAGCAAAGAGTGGGCTGCATCTGGGATTCCCACCAAGGTCTTCAGCCATCAACAAGAGTTGTCTTGTCCCCTCTTGACCCATCTCCCCCTCACTGAATGCCTCAATGTGACCAGGGGTGATTTCAGAGAGGGCAGAGGGGTAGGCAGAGCCTTTGGATGACCAGAACAAGGTTCCCTCTGAGAATTCCAAGGAGTTCCATGAAGACCACATCCACACACGCAGGAACTCCCAGCAACACAAGCTGGAAGCACATGTTTATTTATTCTGCATTTTATTCTGGATGGATTTGAAGCAAAGCACCAGCTTCTCCAGGCTCTTTGGGGTCAGCCAGGGCCAGGGGTCTCCCTGGAGTGCAGTTTCCAATCCCATAGATGGGTCTGGCTGAGCTGAACCCATTTTGAGTGACTCGAGGGTTGGGTTCATCTGAGCAAGAGCTGGCAAAGGTGGCTCTCCAGTTAGTTCTCTCGTAACTGGTTTCATTTCTACTGTGACTGATGTTACATCACAGTGTTTGCAATGGTGTTGCCCTGAGTGGATCTCCAAGGACCAGGTTATTTTAAAAAGATTTGTTTTGTCAAGTGTCATATGTAGGTGTCTGCACCCAGGGGTGGGGAATGTTTGGGCAGAAGGGAGAAGGATCTAGAATGTGTTTTCTGAATAACATTTGTGTGGTGGGTTCTTTGGAAGGAGTGAGATCATTTTCTTATCTTCTGCAATTGCTTAGGATGTTTTTCATGAAAATAGCTCTTTCAGGGGGGTTGTGAGGCCTGGCCAGGCACCCCCTGGAGAGAAGTTTCTGGCCCTGGCTGACCCCAAAGAGCCTGGAGAAGCTGATGCTTTGCTTCAAATCCATCCAGAATAAAACGCAAAGGGCTGAAAGCCATTTGTTGGGGCAGTGGTAAGCTCTGGCTTTCTCCGACTGCTAGGGAGTGGTCTTTCCTATCATGGAGTGACGGTCCCACACTGGTGACTGCGATCTTCAGAGCAGGGGTCCTTGGTGTGACCCTCTGAATGGTCCAGGGTTGATCACACTCTGGGTTTATTACATGGCAGTGTTCCTATTTGGGGCTTGCATGCCAAATTGTAGTTCTTGTCTGATTGGCTCACCCAAGCAAGGCCAAAATTACCAAAAATCTTGGGGGGTTTTTACTCCAGTGGTGAAGAAAACTCCTTTAGCAGGTGGTCCTGAGACCTGACAAGCACTGCTAGGCGAGTGCCAGGACTCCCCAGGCCAGGCCACCAGGATGGCCCTTCCCACTGGAGGTCACATTCAGGAAGATGAAAGAGGAGGTTTGGGGTCTGCCACCATCCTGCTGCTGTGTTTTTGCTATCACACAGTGGGTGGTGGATCTGTCCAAGGAAACTTGAATCAAAGCAGTTAACTTTAAGACTGAGCACCTGCTTCATGCTCAGCCCTGACTGGTGCTATAGGCTGGAGAAGCTCACCCAATAAACATTAAGATTGAGGCCTGCCCTCAGGGATCTTGCATTCCCAGTGGTCAAACCGCACTCACCCATGTGCCAAGGTGGGGTATTTACCACAGCAGCTGAACAGCCAAATGCATGGTGCAGTTGACAGCAGGTGGGAAATGGTATGAGCTGAGGGGGGCCGTGCCCAGGGGCCCACAGGGAACCCTGCTTGCACTTTGTAACATGTTTACTTTTCAGGGCATCTTAGCTTCTATTATAGCCACATCCCTTTGAAACAAGATAACTGAGAATTTAAAAATAAGAAAATACATAAGACCATAACAGCCAACAGGTGGCAGGACCAGGACTATAGCCCAGGTCCTCTGATACCCAGAGCATTACGTGAGCCAGGTAATGAGGGACTGGAACCAGGGAGACCGAGCGCTTTCTGGAAAAGAGGAGTTTCGAGGTAGAGTTTGAAGGAGGTGAGGGATGTGAATTGCCTGCAGAGAGAAGCCTGTTTTGTTGGAAGGTTTGGTGTGTGGAGATGCAGAGGTAAAAGTGTGAGCAGTGAGTTAC AGCGAGAGGCAGAGAAAGAAGAGACAGGAGGGCAAGGGCCATGCTGAAGGGACCTTGAAGGGTAAAGAAGTTTGATATTAAAGGAGTTAAGAGTAGCAAGTTCTAGAGAAGAGGCTGGTGCTGTGGCCAGGGTGAGAGCTGCTCTGGAAAATGTGACCCAGATCCTCACAACCACCTAATCAGGCTGAGGTGTCTTAAGCCTTTTGCTCACAAAACCTGGCACAATGGCTAATTCCCAGAGTGTGAAACTTCCTAAGTATAAATGGTTGTCTGTTTTTGTAACTTAAAAAAAAAAAAAAAAGTTTGGCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGGGGATCACAAGGTCACTAGATGGCGAGCATCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAGTTAGCTGAGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCCACTCGGGAGGCTGAGACAGGAGAATCGCTTAAACCTGGGAGGCGGAGAGTACAGTGAGCCAAGATCGCGCCACTGCACTCCGGCCTGATGACAGAGCGAGATTCCGTCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTTTGTTTTTAAAAAAATCTAAATAAAATAACTTTGCCCCCTG

Nucleotide Sequence (504 nt) cDNA ATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTCCAACTGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACA CGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTA Blue highlighting indicates alternate exons. Translation (167aa): MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT QSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC

LEPTIN SNP rs 7799039 (-2548 G/A) Questo polimorfismo è stato associato ad alti livelli di leptina in soggetti obesi e in sovrappeso. Si trova nella regione del Promotore in posizione - 2548. Una GUANINA può essere sostituita con una ADENINA Il genotipo di un individuo potrà quindi essere : G/G omozigote wilde type 2. A/A omozigote per il polimorfismo 3. G/A eterozigote Nella popolazione europea le tre condizioni si presentano con la frequenza di: G/G = 0,259 A/A= 0,276 A/G = 0,466

PRIMER Forward F : TGGAGGAATCAATGTGCAATG Per individuare il polimorfismo rs 7799039 sono stati disegnati due primer: Forward F : TGGAGGAATCAATGTGCAATG Reverse R : AAAAATACGGACAGAAAC R = G A (purina) Y = T C (pirimidina) F- ---> 5’ TGGAGGAATCAATGTGCAATG….………. ….. G……………….. TTTTTATGCCTGTCTTTG 3’ 3’ ACCTCCTTAGTTACACGTTAC…………………….A……………….AAAAATACGGACAGAAAC 5’ <----R La riuscita della PCR è strettamente legata alla scelta dei Primer che selezionano i frammento di DNA che rappresenta il bersaglio dell’amplificazione. E’ importante che: non contengano basi complementari la T di fusione di entrambi sia identica o quasi

Enzima di restrizione Hha1 5’ GCGC 3’ 3’ CGCG 5’ Il taglio prodotto dall’’enzima HhaI genera estremità sporgenti 3’ protruding

Che cosa ci aspettiamo di vedere con l’elettroforesi ? A/A HhaI non taglia 525 A/G HhaI taglia l’allele G 181 264 Hha1 non taglia l’allele A 525 181 G/G HhaI taglia entrambi gli alleli 264