MATRICE EXTRACELLULARE

insieme di proteine e polisaccaridi, secrete da diversi tipi di cellule, che costituiscono strutture extracellulari in grado di svolgere diverse funzioni diversa concentrazione delle diverse componenti della matrice dà origine a strutture molto diverse tra loro (es, tendini, cartilagini dell’osso…) le funzioni diverse dipendono dalle sostanze che la compongono e dalla loro particolare disposizione

Extracellular matrix – Building blocks Glycosaminoglycans (GAG-s) Glycosaminoglycans (GAG-s)  heparan sulfate - basal membr., cell surface  keratan sulfate - cornea, bone  chondroitin sulfate – cartilage, bone, heart  hyaluronate - synovial fluid  dermatan sulfate - blood vessels, heart „Core-proteins”aggrecan – decorin „Core-proteins”aggrecan – decorin  collagen – elastin - structure  fibronectin – laminin - adhesion

Sizes of ECM Components Collagens - fiber (type I) and network (type IV) forming Multiadhesive proteins - laminin, nidogen, fibronectin GAGs - hyaluronan PGs - aggrecan, perlecan, decorin

FUNZIONI DELLA MATRICE EXTRACELLULARE  supporto tridimensionale  barriera che regola gli scambi sangue-cellula  deposito biologico di molecole con capacità di regolare la attività cellulare  complesso molecolare in grado di indurre e mantenere lo stato differenziato  regolazione della divisione cellulare, adesione, motilità e migrazione cellulare (distruzione controllata della matrice ad opera di proteasi), differenziamento durante l’embriogenesi

LA MATRICE EXTRACELLULARE diversi aspetti d’interesse 1- i suoi costituenti (identificazione strutturale e funzionale) 2- la lamina basale ( sottile ma estremamente complessa) 3- recettori di membrana per i costituenti della matrice 4- segnali intracellulari attivati dal legame tra integrine e molecole della matrice 5- le funzioni cellulari controllate dalla matrice 6- il rimodellamento della matrice (fisiologico, patologico) 7- il ruolo della matrice nello sviluppo embrionale

CELLULE E MATRICE INTERAGISCONO IN MODO DINAMICO INFLUENZANDOSI A VICENDA MATRICE Le cellule sintetizzano la propria matrice extra-cellulare, la quale a sua volta influisce sulle cellule in modo che esse possano perfezionare e mantenere stabilmente il loro fenotipo differenziato. CELLULE

Le cellule aderiscono fisicamente alle matrici extracellulari mediante tutta una serie di recettori per: collageno, laminina, fibronectina, fibrina, proteoglicani, integrine e molte altre molecole Questo permette la trasmissione dei segnali dalla matrice extracellulare alla cellula e viceversa In tal modo, la matrice extracellulare, apparentemente “inerte”, può influenzare l’adesione, la forma, il movimento e perfino l’espressione genica della cellula Il mondo extracellulare

Le cellule che producono le molecole della matrice sono essenzialmente fibroblasti ; In certi tipi specializzati di tessuti connettivi (cartilagine e osso) tali molecole sono secrete da cellule della famiglia dei fibroblasti più specializzate (es, condroblasti e osteoblasti)

Due classi principali di macromolecole extracellulari compongono la matrice extracellulare: -proteine fibrose, fra cui collagene, elastina, fibronectina e laminina che hanno funzioni sia strutturali che adesive. -catene polisaccaridiche della classe chiamata glicosamminoglicani (GAG), che si trovano di solito uniti covalentemente a proteine sotto forma di proteoglicani Glycosaminoglycans (GAG-s) Glycosaminoglycans (GAG-s)  heparan sulfate - basal membr., cell surface  keratan sulfate - cornea, bone  chondroitin sulfate – cartilage, bone, heart  hyaluronate - synovial fluid  dermatan sulfate - blood vessels, heart „Core-proteins”aggrecan – decorin „Core-proteins”aggrecan – decorin  collagen – elastin - structure  fibronectin – laminin - adhesion

PROTEINE FIBROSE organizzazione longitudinale Un’unica struttura secondaria (a-elica, b- foglietto, elica collagenica) Proteine di struttura intra- ed extra-cellulari Insolubili in acqua Formano strutture sopramolecolari Legami covalenti crociati tra le catene collagene, elastina, fibronectina e laminina

I componenti meglio osservabili a livello submicroscopico sono: Le fibre collagene (non ramificate) Le fibre elastiche (ramificate) I proteoglicani (un gel) Le membrane basali (lamine)

Famiglia di proteine fibrose secrete da cellule del tessuto connettivo e da una varietà di altri tipi cellulari. Sono le proteine più abbondanti nei mammiferi 1/3 rd of the total proteins Found abundantly in tendon, cartilage, bone and skin (costituiscono pelle ed osso). Danno origine a fibre semicristalline che tengono in posizione le cellule, conferiscono resistenza alla tensione ed elasticità alla matrice; svolgono funzioni importanti nell’ambito della mobilità e dello sviluppo delle cellule. Glicoproteine per lo più insolubili, caratterizzate da un contenuto elevato di Gly e di 2 aa modificati: idrossi-Lys e idrossi-Pro.Collagene

Singole molecole di collagene sono strutture lineari costituite da 3 catene polipeptidiche. Le singole catene, dette catene , si avvolgono a formare un’elica sinistrorsa a passo lungo. I residui di Pro, a spaziatura regolare, sono importanti per la stabilizzazione di questa struttura elicoidale. 3 catene  si associano tra loro a formare una tripla elica destrorsa, relativamente rigida; tale struttura è possibile grazie all a spaziatura regolare dei residui di Gly (stanno nell’asse centrale). La tripla elica è responsabile della natura fibrosa. A seconda del tipo di collagene, la tripla elica può essere continua, o può contenere regioni che danno origine a strutture a conformazione meno ordinata. Questi elementi fungono da regioni cardine e danno maggiore flessibilità. Tripletta Gly-X-Y– X: Pro; Y: Hypro

3 catene  si associano tra loro a formare una tripla elica destrorsa, relativamente rigida; tale struttura è possibile grazie all a spaziatura regolare dei residui di Gly (stanno nell’asse centrale). La tripla elica è responsabile della natura fibrosa.  1.5 nm diametro  Almeno 28 differenti topi di collagene  le tre α-chains possono essere uguali (collagen II) o diverse (collagen I) A seconda del tipo di collagene, la tripla elica può essere continua, o può contenere regioni che danno origine a conformazione meno ordinata. Questi elementi fungono da regioni cardine e danno maggiore flessibilità.

Sintesi e associazione del collagene

FIBRILLA FIBRA TRIPLA ELICA

Legami incrociati formati tra catene laterali di lisine modificate in una fibrilla di collagene Lisine ed idrossilisine possono essere deaminate dalla lisil ossidasi. Si producono gruppi aldeidici altamente reattivi

Negative staining of collagen fibrils gaps between collagen molecules collagen

Classificazione del collagene  No interruptions in triple helix  Regular arrangement results in characteristic “D” period of 67 nm  Diameter : nm  Example : Types I, II, III, V, XI 1. Fibril-forming collagens

 Forms network in basement (Collagen IV) and Descemet’s membrane (Collagen VIII)  Molecular filtration  Example : Types IV, VIII, X 2. Network-forming collagens Classificazione del collagene

 Short collagens with interruptions  Linked to collagen II and carries a GAG chain  Found at the surface of fibril-forming collagens  Example : Types IX, XII, XIV 3. Fibril-associated collagens with interrupted triple helices (FACITs) Classificazione del collagene

04/19/10  Provides functional integrity by connecting epithelium to stroma  Example : Type VII 4. Anchoring collagens Classificazione del collagene

04/19/10  Form structural links with cells  Example : Type VI  Collagen VI crosslink into tetramers that assemble into long molecular chains (microfibrils) and have beaded repeat of 105 nm 5. Beaded-filament-forming collagens Classificazione del collagene

04/19/10 Tipe I Fibril assembly Chain recognition sequence Fibril assembly is determined by chain recognition sequence in C-propeptide Fish scale Bone osteon Tendon Skin

Clinical approaches Collagen Collagen hydroxy-Pro  hydroxy-Lys  cross-linking  N-term. propeptide - poor wound healing - hyperextensibility - musculo-skeletal deformities deformities

Malattie associate al collagene Diseases caused by mutations  Subtypes of osteogenesis imperfecta (collagen I)  Ehlers-Danlos syndrome (collagen I and V)  Alport syndrome (collagen IV)  Certain arterial aneurysms (collagen III)  Ullrich muscular dystrophy (collagen VI)  Certain chondrodysplasias (collagen IX and XI)  Kniest dysplasia (collagen II)

I DIFETTI EREDITARI DEL COLLAGENE Osteogenesi imperfetta tipo 1 Quadro clinico: Fratture frequenti alle ossa lunghe. braccia,gambe,costole Guarigione delle fratture Possibile perdita dell’udito Quadro biochimico: Molte mutazioni diverse a carico della catena  1 (I) del collagene 1 allele mutato = riduzione del 50% della sintesi di catene alfa Solo metà della quantità normale di collagene sintetizzato. L’eccesso di catene  2 viene degradato

Alterazioni a carico di singole catene di collagene alterano la formazione delle fibre normale patologico

O.I. DI TIPO I E DI TIPO II  1 null  1 mut (  1 o  2 mut)

Matrix types produced by vertebrate cells COLLAGENE IChS, DSfibrobl. IIfibronectinChSintegrinchondrocyte IIIHS, Hep.hepatocyte epithel IVlamininHS, Hep.laminin rec.epithel, endothel,regenerating hepatocyte hepatocyte VfibronectinHS, Hep.integrinresting fibrobl. VIfibronectinHSintegrinresting fibrobl. AnchorProteogly.ReceptorCells Abbr.: ChS – chondroitin sulfate; DS – dermatan sulfate; HS – heparan sulfate; Hep - heparin HS – heparan sulfate; Hep - heparin

FIBRE ELASTICHE

Elastina: 750 aminoacidi, 72 kDa, 33% Gly Molti aminoacidi apolari, senza periodicità, non glicosilata – Senza HyPro e HyLys, ma con desmosina (gialla) Sintesi come per collagene – Precursore solubile – Modificazioni posttranslazionali – Insolubilizzazione nello spazio extracellulare – Lys → desmosina ad opera di Lys ossidasi (Cu++) – Copertura con uno strato di microfibrille (fibrilline)

Molti tessuti (ad es. pelle, vasi sanguigni, polmoni) hanno bisogno di essere sia resistenti che elastici per funzionare. La resilienza è data da una rete di fibre elastiche che permette il riavvolgimento dopo uno stiramento transitorio. FIBRE ELASTICHE FIBRE ELASTICHE Comuni nei tessuti che richiedono la capacità di deformarsi ripetutamente e reversibilmente. Hanno una zona centrale amorfa che consiste di elastina, circondata da piccoli filamenti a perline, le microfibrille. La componente principale delle microfibrille è la grande glicoproteina, fibrillina.

eLASTINA Rete nella matrice, possono tenere insieme fibre di collagene. Componente principale è l’ELASTINA (proteina altamente idrofobica, ricca di Pro e Gly, non glicosilata). L’elastina è prodotta a partire da un precursore (TROPOELASTINA) solubile secreto nello spazio extracellulare.

L’elastina viene inizialmente sintetizzata come monomero solubile, la tropoelastina, che viene secreta dalle cellule. Dopo la secrezione, i monomeri di tropoelastina subiscono legami incrociati mediante l’azione dell’enzima lisil ossidasi. L’elastina con i legami incrociati è una proteina estremamente insolubile. Il gene umano contiene 36 esoni ( coppie di basi). Il turnover dell’elastina è estremamente basso, con una emi- vita che si avvicina all’età dell’organismo. L’elastina è sintetizzata soprattutto durante lo sviluppo e qualsiasi elastina “danneggiata” o non viene sostituita oppure è sostituita da fibre non funzionali. Una eccessiva degradazione dell’elastina è osservata in malattie gravi, quali l’enfisema e l’aterosclerosi.

Dopo la secrezione, le molecole di elastina vengono collegate da un gran numero di legami incrociati, generando una estesa rete di fibre e strati. I legami incrociati vengono formati fra residui di lisina, mediante un meccanismo simile a quello che produce i legami incrociati nelle molecole di collagene. La proteina elastina è composta in gran parte da due tipi di segmenti corti, ciascuno codificato da un esone diverso, che si alternano lungo la catena polipeptidica:  Segmenti idrofobici responsabili per le propriet à elastiche della molecola  Segmenti ad  -elica ricchi in lisina, che formano legami incrociati fra molecole adiacenti

elastina

AORTA Alterazioni delle gene per la fibrillina provocano la sindrome di Marfan, una malattia genetica relativamente comune che colpisce i tessuti connettivi, ricchi in fibre elastiche: negli individui colpiti in modo più serio l’aorta, la cui parete è normalmente piena di elastina, è soggetta a rompersi

Le fibre elastiche, tuttavia, non sono composte solo di elastina: la zona centrale di elastina è ricoperta da uno strato di microfibrille, ciascuna delle quali ha un diametro di circa10 nm. Microfibrille dello stesso tipo si possono trovare anche in MECs che non contengono elastina. Le microfibrile sono composte da un gran numero di glicoproteine diverse, che inclusono la glicoproteina di grandi dimensioni fibrillina che sembra essere essenziale per l ’ integrit à delle fibre elastiche.. Si pensa che le microfibrille giochino un ruolo importante per l ’ assemblamento delle fibre elastiche: compaiono prima dell ’ elastina durante lo sviluppo embrionale e sembrano formare una impalcatura su cui viene depositata l ’ elastina secreta. Mentre l ’ elastina viene depositata, le microfibrille vengono spostate verso la periferia della fibra in crescita.

SINDROME DI WILLIAMS MICRODELEZIONI Williams syndrome is a rare genetic disorder that affects a child's growth, physical appearance, and cognitive development. People who have Williams syndrome are missing genetic material from chromosome 7, including the gene elastin. This gene's protein product gives blood vessels the stretchiness and strength required to withstand a lifetime of use. The elastin protein is made only during embryonic development and childhood, when blood vessels are formed. Because they lack the elastin protein, people with Williams Syndrome have disorders of the circulatory system and heart defects.

Williams Deletion Region

FIBRONECTINA Proteina multiadesiva: possibili molti tipi di interazioni con differenti molecole Ruolo nell’embriogenesi (controllo delle ondate migratorie e del differenziamento) Partecipa ai processi di coagulazione e riparo delle ferite DIVERSI GRADI DI SOLUBILITA’ - LA FIBRONECTINA EMATICA E’ SOLUBILE (è prodotta dal fegato e manca di EDA e EDB)

DOMINI: fibrina, fibrina eparan solfato eparan solfato integrina collagene DOMINI DELLA FIBRONECTINA 1 GENE - 1 TRASCRITTO PRIMARIO - CIRCA 20 CATENE POLIPEPTIDICHE 6 DOMINI FUNZIONALI - SEQUENZE RIPETUTE DI 3 TIPI DIFFERENTI LA SEQUENZA RGD (nel dominio tipo III) DETERMINA L’INTERAZIONE COL RECETTORE INTEGRINICO

Fibronectinscollagen cell heparin Dimer composed by different by different channels – channels – alternative splicing RGD LA REGIONE CONTENENTE RGD E’ ESPOSTA VERSO L’ESTERNO

Figure 19-72b, c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

LA REGIONE CONTENENTE RGD E’ ESPOSTA VERSO L’ESTERNO Arg Gly Asp

GLICOSAMMINOGLICANI E PROTEOGLICANI

GLICOSAMMINOGLICANI: Sono catene polisaccaridiche non ramificate composte da unità ripetute di disaccaridi. Uno degli zuccheri è sempre uno zucchero amminico (nella maggior parte dei casi è solfato). Il secondo zucchero è di solito un acido uronico (glucuronico o iduronico) I GLICOSAMINOGLICANI OCCUPANO SPAZIO E FORMANO GEL IDRATATI. I GAG che spesso sono legati a proteine formando proteoglicani sono sintetizzati nell'apparato del Golgi dove in seguito a modifiche post-trascrizionali le unità disaccariche vengono aggiunte ai core proteici.proteineproteoglicaniapparato del Golgi

l'acido ialuronico, non è parte di proteoglicani viene prodotto da enzimi presenti sulla superficie esterna della membrana plasmatica direttamente in sede extracellulare.acido ialuronicoproteoglicani enzimimembrana plasmatica Conferisce consistenza e resistenza soprattutto alle forze di compressione Durante lo sviluppo embrionale: regola la migrazione cellulare controllata da ialuronidasi E’ presente nel fluido articolare Interviene nella riparazione delle ferite Glicosaminoglicano non legato covalentemente a proteine Acido ialuronicoN-

ACIDO IALURONICO Res. idrofilico Attrae cationi disaccaride ripetuto Sequenze ripetuta di disaccaride nell’ialuronato, un GAG relativamente semplice. Questa molecola ubiquitaria nei Vertebrati consiste di una singola ed unica catena contenente fino a zuccheri. Notarel’assenzadigruppisolfato.

PROTEOGLICANI: Sono prodotti dalla maggior parte delle cellule animali. La catena polipeptidica, o nucleo proteico, è prodotta dai ribosomi del RER e introdotta nel lume. Le catene polisaccaridiche sono assemblate su questo nucleo principalmente nell’apparato del Golgi. Qui vengono anche aggiunti gli zuccheri. Le molecole di proteoglicano nel tessuto connettivo formano una “sostanza basale” simile a gel altamente idratata in cui le proteine fibrose sono immerse. Le fibre di collagene rafforzano e aiutano ad organizzare la matrice e fibre di elastina simili a gomma le danno elasticità. Grande varietà Variabilità di composizione della componente saccaridica dei GAG Grande numero di core protein

Proteoglicani Complesso di una“core protein”e glicosaminoglicani GAGs sonoripetizioni di disaccaridi lineari con modificazioni dei gruppi aminici Spesso solfatati Sempre negativi Perciò, i GAGs idrofilici si respingono uno con l’altro Formano un amatrice idratata capace di assorbire fino a 1000 Volte in loro volume in acqua.

Ac.uronico Acetilglucosamina Acetilgalattosamina galattosio solfatazione PROTEOGLICANI

ProteoglycansProteoglycans consist of a protein core (brown) and one or more covalently attached glycosaminoglycan chains ([blue] HS; [yellow] CS/DS). Membrane proteoglycans either span the plasma membrane (type I membrane proteins) or are linked by a GPI anchor. ECM proteoglycans are usually secreted, but some proteoglycans can be proteolytically cleaved and shed from the cell surface (not shown). proteoglycansGPI anchor proteoglycans

After secretion, cell- surface heparan sulfate proteoglycans can be processed further. Heparanase cleaves the HS chain, liberating oligosaccharides and bound ligands. The Sulfs remove sulfate groups from subsets of 6-O- sulfated N-sulfated glucosamine units and can modulate growth factor signaling.heparan sulfate proteoglycans oligosaccharidesligands

Table 19-6 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Aggrecan One complex of aggrecan: M.W. about 10 8 M.W. about 10 8 Volume 2x ml Volume 2x ml (= bacterium) (= bacterium)

Chapter 16, Figure 1 The large cartilage CS proteoglycan (aggrecan) forms an aggregate with hyaluronan and link protein Essentials of Glycobiology Second Edition

AGGRECANO ialaderine

AGGRECANO

Keratan sulfatesKeratan sulfates contain a sulfated poly-N-acetyllactosamine chain linked to either Asn or Ser/Thr residues. The actual order of the various sulfated and nonsulfated disaccharides occurs somewhat randomly along the chain. Not shown are sialic acids that may be present at the termini of the chains and fucose residues attached to N- acetylglucosamine units. poly--acetyllactosaminesialic acids

PROTEOGLICANI INSERITI NELLA MEMBRANA

LAMINE BASALI: Sottili tappeti flessibili di matrice specializzata, sottostanti ai fogli e tubi di cellule epiteliali. Funzione di separazione e filtro (glomerulo); determinano la polarità cellulare, influenzano il metabolismo. Sintetizzata in gran parte dalle cellule che si trovano su di essa; fibrille di ancoraggio composte soprattutto da collagene di tipo IV. Ruolo ISTRUTTIVO nella rigenerazione (giunzione neuromuscolare).

Basal lamina Layers: lamina lucida lamina densa lamina fibroreticularis CellConnectivetissue Components:IV. collagen lamininperlecanentactin

COLLAGENE TIPO IV LAMININA PERLECANO ENTACTINA LA LAMINA BASALE

External Lamina External lamina surrounds muscle cells, adipocytes, and Schwann cells (peripheral nerve supporting cells) Basal lamina shared by two epithelia in the kidney glomerulus is "free" to function as a molecular filter

Organizzazione a moduli ripetuti

Collagen IV Perlecan Laminin Entactin

Laminin A chain B 1 chain B 2 chain Globulardomains  helix each chain has more types each chain has more types 18 isoforms of laminin 18 isoforms of laminin diversities in tissues diversities in tissues

Eparan solfato Neuriti Integrine e lipidi Collagene e lipidi a-elica Collagene IV Lipidi LAMININA

Laminine e proteoglicani nel tessuto muscolare Connessione con la distrofina

Laminine e proteoglicani nel tessuto muscolare Connessione con la distrofina

LAMININA E MIGRAZIONE UN CHERATINOCITA MIGRA SU LAMININA DA ESSO PRODOTTA

TETRAMERO DI COLLAGENE IV

ASSEMBLAGGIO DEL COLLAGENE IV NELLA LAMINA BASALE

MMP

Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Endothelial Cell Activation Secretes MMPs that digest surrounding matrix Cell migrates and divides Matrix Activated endothelial cell