ATTIVITÀ INTRACELLULARE GENETICA INTERAZIONE AMBIENTALE INTERAZIONE CELLULA-CELLULA

Colture cellulari Colture di cellule vegetali Colture primarie di cellule animali Linee cellulari In sospensione Adese

DI TESSUTO PRIMARIE LINEE A BREVE TERMINE COLTURE Non Tumorali LINEE CELLULARI CONTINUE Tumorali LINEE INGEGNERIZZATE

Coltura primaria: una coltura iniziata da un espianto di COLTURE CELLULARI: Coltura primaria: una coltura iniziata da un espianto di cellule, tessuti od organi prelevati da un organismo. Una coltura si definisce primaria sino alla sua prima subcoltura:a questo punto diventa linea cellulare primaria. Subcoltura: raccolta di cellule da una coltura e loro utilizzo per dare inizio ad una nuova coltura. Questo termine è sinonimo di passaggio. Linea cellulare: una coltura cellulare che emerge da un espianto primario dopo la prima sub-coltura. la linea cellulare implica che le colture che ne derivano siano costituite da cellule originariamente presenti nella coltura primaria.

Evoluzione di una linea cellulare in coltura Tra la “semina” e la ripresa della crescita c’è un intervallo. Il grafico mostra l’evoluzione del logaritmo del numero di cellule nel tempo. La coltura primaria è caratterizzata da un tempo di duplicazione lento, che aumenta notevolmente nei successivi passaggi in coltura, quando si parla di linea cellulare primaria. Nella terza fase si nota la senescenza, con tempi di dupli-cazione progressivamente più lunghi (sino alla morte), a meno che (porzione arancione) non intervenga una trasformazione, a produrre una linea cellulare immortalizzata, in grado di replicarsi indefinitamente.

Linea cellulare continua: una popolazione di cellule che può essere propagata per un numero infinito di passaggi. Linea cellulare finita: una coltura di cellule in grado di proliferare per un numero limitato di volte dopo le quali cessa di proliferare.

Il laboratorio di Biologia cellulare cappa incubatore centrifuga Alcune norme pratiche: • Il laboratorio di colture cellulari deve essere usato esclusivamente a questo scopo • Usare esclusivamente cappe a flusso laminare sterile • Tutto il materiale utilizzato deve essere sterile • Utilizzare unicamente il pipettatore automatico

Cappa a flusso laminare Flusso laminare: flusso unidirezionale formato da filetti di aria sterile, filtrata attraverso filtri HEPA, paralleli tra loro ed aventi tutti la stessa velocità, generalmente di 0,5 m/sec. I filetti di aria sterile trascinano lontano dall’area di lavoro i contaminanti ed evitano la formazioni di vortici. Filtri HEPA(High Efficiency Particulate Air): prevengono la contaminazione particellare, sono costituiti da fogli di microfibre di vetro ripiegati più volte per aumentare la superficie filtrante; l’efficienza è la capacità di trattenere particelle di 0,3 micron di diametro e deve essere compresa tra 99,97% e 99,99%. Le cappe a flusso laminare garantiscono principalmente la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell’operatore e dell’ambiente

Cappa a flusso laminare

●Cappe biologiche di classe II: maggiormente impiegate in laboratori di ricerca e microbiologici, sono anche definite cappe di sicurezza microbiologica ●Cappe biologiche di classe III: caratterizzate da una chiusura totale ermetica, funzionano a pressione negativa; le manipolazioni all’interno della camera sono consentite da due o più guanti di gomma incorporati nella struttura della cappa. I campioni, in contenitori chiusi, sono introdotti tramite un sistema di doppi sportelli. Hanno un filtro HEPA sull’aria in ingresso ed un doppio filtro HEPA sull’aria in uscita -Protezione totale dell’operatore e dell’ambiente. -Manipolazioni ad alto rischio biologico

Per quanto riguarda le cappe biologiche di classe II si devono osservare queste norme: • Il piano di lavoro deve essere pulito in successione con acqua distillata e alcool denaturato all’inizio e alla fine di ogni manipolazione • Si deve aver cura di non lasciare macchie di terreno e siero sul piano di lavoro • Controllare periodicamente la cappa cambiando i filtri assoluti in base alle ore di utilizzo ( circa 5000) Un test pratico per verificare la sterilità del flusso laminare nella cappa consiste nel lasciare una capsula di Petri aperta con terreno per colture batteriche sotto cappa per 3-4 ore e quindi incubarla a 37°C per verificare eventuali Contaminazioni (….LOGICAMENTE non nell’incubatore delle colture cellulari)

Perché si utilizzano gli incubatori? Il sistema tampone utilizzato nei terreni è il HCO3/CO2. Per questo motivo devono essere coltivate in atmosfera al 5% di CO2 e necessitano quindi di incubatori con sistema di controllo dall’atmosfera.

Contaminazioni delle colture L’ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di coltura è dannoso, in quanto questi competono con le cellule in coltura (che generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono secernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri, micoplasmi, lieviti, muffe. In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) e intorbidisce. Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al terreno (ad esempio: streptomicina-penicillina); va ricordato che sono stabili per pochi giorni a 37°C.

Sterilità Al fine di mantenere la sterilità per la coltura cellulare occorre lavorare sotto cappe a flusso laminare, alle quali vanno sostituiti periodicamente i filtri. Per la sterilizzazione dei materiali: Stufa a secco, 150°C per 3 ore    per la vetreria Autoclave (calore umido), 1 atm, 121°C  per filtri, soluzioni saline… Filtrazione con filtri da 0.22 μm  terreni di coltura, soluzioni organiche…                                     

Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni Sterilità soluzioni e terreni utilizzati Contaminazioni batteriche antibiotici Contaminazioni miceti anfotericina B (2,5µg/ml) sono a volte tossici per le cellule Materiale monouso sterile Non esistono sistemi di prevenzione per infezioni virali o micoplasma Non utilizzare l’animale nella cappa sterile in quanto portatore di contaminazione

Piastre di coltura Piastre Petri Fiasca con tappo ventilato                                                                                  Fiasca con tappo ventilato Superficie: 25-235 cm2 Piastre multipozzetto (multiwell) (6-384 pozzetti)

Prevenzione: corretto uso della cappa biologiaca Separare sezione di lavoro da sezione di scarto. Non posizionare materiale sui bordi Evitare movimenti che alterino il flusso laminare Non parlare mentre si è sotto cappa non posizionare oggetti tra l’origine del flusso ed altro materiale (colture) Disinfettare tutto ciò che entra nella cappa Non sovraccaricare la cappa Area di scarto Area pulita Area di lavoro

Antibiotici sempre? • Vengono utilizzati generalmente a scopo preventivo per evitare contaminazioni batteriche. • Di norma si utilizzano penicillina e streptomicina in alcuni casi viene utilizzata anfotericina B come antimicotico • Si può lavorare anche senza, non sono necessari per la crescita cellulare • Un possibile inconveniente all’uso sistematico degli antibiotici è lo sviluppo ceppi resistenti agli antibiotici usati con notevole danno alle colture.

Micoplasmi Prevenzione, rilevazione e rimozione I micoplasmi sono piccoli batteri(<1um) che mancano della parete cellulare. Alcuni sono patogeni in umani e animali. Poiché mancano della parete cellulare, sono immuni alla maggior parte degli antibiotici più comuni che agiscono sulla sintesi della parete. Inoltre possono passare i filtri sterilizzanti (0,2um). Molte specie di Micoplasma possono infettare le colture cellulari. Molto spesso sono dovute all’operatore o alla presenza di elementi contaminanti nel tereno di coltura

Prevenzione La contaminazione di incubatori, bagni e banchi di lavoro sterili è spesso un problema molto serio, che può portare a danni molto steri Diversi prodotti presenti sul mercato: 1-SOLUZIONI PER DISINFETTARE INCUBATORI CO2 2-SOLUZIONI DISINFETTANTI PER BAGNI ED ACQUA 3-SOLUZIONE DISINFETTANTE SPRAY PER LA PULIZIA (COMPOSTI QUATERNARI DEL BENZIL AMMONIO)

RIVELAZIONE Perché fare un test per verificare la presenza di micoplasma? Le colture cellulari offrono condizioni di vita ideali per il micoplasma: La contaminazione è sempre possibile. Anche in presenza di un forte inquinamento non si osserva alcuna torbidità del terreno e non vi sono elementi visibili che indicano la presenza di un inquinamento. Tuttavia le funzioni cellulari vengono influenzate e i risultati sperimentali possono essere interpretati in modo errato.

Panoramica dei metodi esistenti Metodo Dispositivi necessari/ valutazione Metodo con sonde fluorescenti Microscopio a fluorescenza/ veloce poco costoso, poco sensibile Metodi biochimici Nessuno/ richiede indicatori, bassa sensibilità, facile Metodi con kit immunoenzimatici Lettore Elisa/ specifici per specie distinte, media sensibilità Metodi con PCR Termociclatore, sistema per elettroforesi sistema di acquisizione/ alta sensibilità, specie e tipo specifico

Quando eseguire un test? Tutte le volte che nuove colture di cellule entrano in laboratorio Almeno ogni 3 mesi Prima di ogni conservazione in azoto liquido A seguito di modifiche delle caratteristiche cellulari In caso di problemi di riproducibilità degli esperimenti

In caso di contaminazione Immediata quarantena (o eliminazione) e verifica di tutte le colture crioconservate o dei campioni derivati Informare tutti coloro che possono aver ricevuto materiale a contatto con la coltura contaminata Disinfezione standard del laboratorio Iniziare trattamento contro il micoplasma in caso di cellule “non sostituibili”

Trattamento delle colture contaminate Antibiotici: fluoroquinolone o BM-cicline o altre tetracicline Metodi fisici e chimici es Foto inattivazione con Hoechst 3325875-Bromuracil,

Media Type Examples Use Balanced salt solutions Basal media PBS, Hanks’BBS, Earle’s salts DPBS HBSS EBSS Form the basis of many complex media Basal media MEM Minimum essential Medium DMEM Dulbecco’s modification of Mem GMEM PRIMARY CULTURE Modification of Mem containing increased level of amino acids and vitamins. Glagows modified MEM was defined for BHK-21 cells Complex media RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute Leibovits L-15 Originally derived for human leukaemic cells. It support a wide range of mammalian cells. Designed for CO2 free environments Serum free media DMEM/F12 Neurobasal These media must be supplemented with other factors such as insulin, transferrin and epidermal growth factor.

Costituenti base dei terreni Sali inorganici Carboidrati Aminoacidi Vitamine Acidi grassi e lipidi Proteine e lipidi Siero

Sali inorganici Mantengono l’equilibrio osmotico Aiutano a mantenere il potenziale di membrana Sono richiesti dalla matrice extracellulare per l’adesione cellulare Sono cofattori enzimatici

Sistemi tampone Sistema bicarbonato è un sistema naturale e richiede un’atmosfera controllata 5-10% CO2 Hepes: è una molecola sintetica non tossica con forte potere tamponante, si utilizza di solito alla concentrazione di 20mM. L’Hepes non richiede un’atmosfera controllata, ma ha l’inconveniente di essere caro e di non essere gradito da tutte le cellule. Utile quando si manipolano le cellule per lunghi tempi fuori dall’incubatore. La CO2 dell’atmosfera non è sufficiente mantenere il PH neutro per cui il terreno si alcalinizza con conseguente danno delle cellule. Molti media contengono il rosso fenolo un indicatore di pH Indicatore con colore rosso-arancio a PH 7,3 vira al giallo a PH acido ( 6,8-7,0) e vira al rosso-viola a PH alcalino (>7,6)

Gli aa essenziali devono essere aggiunti al terreno di crescita Carboidrati Glucosio e galattosio Maltosio e Fruttosio Concentrazione 1g/l- 4,5g/l Aminoacidi Gli aa essenziali devono essere aggiunti al terreno di crescita Le quantità da aggiungere variano dal tipo cellulare con cui si sta lavorando. La glutammina è l’AA essenziale più usato nelle colture cellulari. Questo AA è labile pertanto se il terreno viene conservato a 4°C per tempi più lunghi di 15 giorni è necessario riaggiungere glutamina al terreno al momento dell’uso

Vitamine Proteine e peptidi Le vitamine comunemente contenute nei terreni sono la riboflavina , la tiamina e la biotina. (siero) Il siero è una fonte di vitamine, per le colture che crescono in terreno serum free è necessario aggiungerele. Proteine e peptidi Le vitamine comunemente contenute nei terreni sono l’albumina, transferrina, fibronectina. (siero)

Siero Il siero contiene albumina, fattori di crescita ed inibitori della crescita. Il siero più comunemente usato è il Foetalbovin serum (FBS) La qualità, il tipo e la concentrazione di siero possono interferire notevolmente sulla crescita cellulare Il siero aumenta la capacità tamponante del terreno Protegge le cellule dal danno meccanico Il siero può legare e neutralizzare le tossine Possono verificarsi contaminazioni associate all’uso del siero

Il siero Vantaggi Svantaggi Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità; Introduce fattori di crescita ed ormoni; Veicola lipidi, ferro e molecole organiche; Favorisce interazione cellule-substrato; Contiene inibitori della tripsina Svantaggi Possibile tossicità degli anticorpi; Variabilità da lotto a lotto; Inibitori metabolici; Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari

Coltura primaria Le cellule derivano direttamente dal tessuto d’origine, mantenendo molte caratteristiche funzionali riscontrabili in vivo. Durante la crescita avviene una selezione in base al grado di proliferazione: aumentano cellule attivamente proliferanti, restano stazionarie quelle in grado di sopravvivere, ma non di duplicarsi, mentre altri tipi di cellule sono incapaci di resistere. ES. colture neuronali e astrocitarie

Colture primarie Prelievo delle cellule da un campione (organo, embrioni). dissezione meccanica. Trattamento con tripsina (o altro enzima) per eliminare i contatti tra cellule. Inibitore per bloccare la digestione enzimatica Controllo della vitalità cellulare (ad esempio trypan blue) Le colture cellulari possono essere seminate in piastra Petri oppure in sospensione. Nella figura a lato sono schematizzate le tappe principali per ottenere una coltura primaria, ovvero una coltura di cellule direttamente da un organismo, messa in piastra. 1.        Prelievo delle cellule da un campione, quale organo di un adulto, embrioni o uova. 2.       Dalla biopsia si esegue una dissezione meccanica. 3.       Trattamento con tripsina (eliminazione dei contatti proteici delle cellule con la matrice) e con EDTA, un chelante del calcio, richiesto dall’integrina per ancorarsi alla fibronectina (vedi sotto). Questo trattamento serve a disgregare i contatti fra cellule. 4.       Si blocca la digestione enzimatica con un inibitore (lo stesso siero animale, addizionato al terreno di coltura, contiene alcuni inibitori). 5.        Si centrifuga la sospensione cellulare, e le cellule vengono risospese. A questo punto effettuo un controllo della vitalità cellulare (ad esempio con colorazione trypan blue che penetra solo nelle cellule morte, con danni alle membrane, per cui le cellule integre risultano incolori). Le colture cellulari possono crescere in monostrato (seminate su terreno solido in piastra Petri) o in sospensione, quando possono moltiplicarsi anche senza aderire ad un substrato o non presentano alcuna forma di adesione. In alcuni casi non è necessario l’uso di un agitatore per ottenere colture in sospensione, che sono senz’altro indicate quando servano grandi quantità di cellule

Colture primarie Norme generali: • Grasso e tessuto necrotico devono essere eliminati Questa operazione va effettuata con strumenti adatti per causare il minimo danno e preferibilmente sotto stereomicroscopio. • Gli enzimi utilizzati per la disgregazione devono essere inibiti ed eliminati con una centrifugazione delicata • La concentrazione di cellule nella cultura primaria dovrebbe essere più alta di quella che poi utilizzeremo nella subcultura • Utilizzare dove possibile un medium ricco Es DMEM/F12 • Tessuto embrionale è da preferirsi ( più facilità nella disgregazione, più cellule vitali,proliferazione più rapida nella cultura primaria rispetto al tessuto adulto)

Colture primarie LA DISSEZIONE Grasso e tessuto necrotico devono essere eliminati Questa operazione va effettuata con strumenti adatti per causare il minimo danno e preferibilmente sotto stereomicroscopio.

Colture primarie Disgregazione enzimatica Generalmente i protocolli di isolamento prevedono una prima fase il cui scopo è quello di separare i diversi tipi cellulari presenti nel tessuto demolendo la matrice extracellulare e le giunzioni intercellulari che le mantengono unite. A tale scopo il tessuto viene incubato con enzimi proteolitici (tripsina e/o collagenasi) dissociando le singole cellule mediante tecniche meccaniche. Gli enzimi utilizzati per la disgregazione devono essere inibiti ed eliminati con una delicata centrifugazione

Alla fase di dissociazione segue la fase di separazione dei vari tipi cellulari da una sospensione cellulare mista Si può procedere in vari modi: 1. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o al loro peso, centrifugandole a bassa velocità con l’ausilio di sostanze (es Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che creano gradienti a diversa densità; 2. Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire su superfici di vetro o di plastica; 3. Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti, e separando le cellule marcate da quelle non marcate; 4. Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita solo di alcuni tipi cellulari e/o aggiungendo al terreno di coltura ormoni che favoriscono (o inibiscono) la crescita di determinati tipi cellulari.

La sospensione cellulare omogenea così ottenuta è messa in “coltura”, cioè viene trasferita in contenitori appositi contenenti miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie al sostentamento delle cellule. Le cellule crescono adese o in sospensione. Le cellule adese crescono aderendo al supporto su cui sono state seminate (cioè sulla parete della fiasca) crescono formando monostrati (se sono sane, in quanto risentono dell’inibizione da contatto) o pluristrati (se sono tumorali e quindi non risentono dell’inibizione da contatto). Le cellule in sospensione sono cellule che non crescono adese alla parete della fiasca, ma sospese nel terreno di coltura senza aderire ad alcun supporto.

Linee cellulari Linee cellulari a vita finita Resistono in coltura un numero limitato di cicli cellulari; crescono in monostrato risentendo dell’inibizione da contatto; fortemente dipendenti da fattori di crescita presenti nel siero. Linee cellulari continue (trasformate) hanno origine da mutazioni (spontanee o indotte con agenti chimici, fisici o biologici) a partire da colture primarie o da linee cellulari a vita finita; possono essere ottenute anche da tumori. Presentano minore dipendenza da fattori del siero e minore inibizione da contatto. Quando si effettua una subcoltura si parla di linee cellulari, che possono essere divise in: §         Linee cellulari a vita finita – hanno un corredo cromosomico diploide, la maggior parte della popolazione cellulare ha lo stesso cariotipo, resiste in coltura un numero limitato di cicli cellulari. Crescono in monostrato risentendo dell’inibizione da contatto, e sono fortemente dipendenti da fattori di crescita presenti nel siero, §         Linee cellulari continue (trasformate) – hanno origine da mutazioni (spontanee o indotte con agenti chimici, fisici o biologici) a partire dalle colture primarie o dalle linee cellulari a vita finita, e naturalmente possono essere ottenute direttamente da tumori. Presentano una minore dipendenza da fattori del siero e minore inibizione da contatto. §         Linee cellulari clonali – sono linee cellulari dericanti per mitosi da una singola cellula, servono per ottenere una popolazione il più possibile omogenea

Trasformazione di una linea cellulare Il processo della trasformazione rende immortale una linea cellulare. ll processo ha inizio con l’acquisizione da parte della linea cellulare della capacità di proliferare indefinitamente (immortalizzazione); richiede un certo numero di mutazioni in geni diversi. Quando avviene (anche spontaneamente) in coltura, si osservano al microscopio dei foci di trasformazione, ovvero delle clusters di cellule simili a quelle tumorali, che non risentono della inibizione da contatto.

Dove trovare le linee cellulari • Produzione in laboratorio • Banche cellule – European Collection of Cell Culture www.ecacc.org.uk – AmericanTissueCultureCentre (USA) www.atcc.org – National Cell Culture Center (USA) www.nccc.com – German Collection of Microorganism and Cell Culture www.dsmz.de – IZS Centro Substrati Cellulari www.bs.izs.it – IST Servizio Biotecnologie www.biotech.ist.unige.it

PROTOCOLLO PER LA PROPAGAZIONE DI UNA COLTURA CELLULARE Protocollo per le subcolture Da una fiasca contenente cellule a confluenza: Scartare il terreno di coltura; Lavare con terreno senza siero o PBS; Aggiungere tripsina; Lasciar agire la tripsina per circa 5-10 min a 37°C; In questo tempo preparare un tubo contenente terreno + FBS al 10%; Trascorsi i 5 minuti, verificare che le cellule si siano staccate; quindi aggiungere il DMEM + FBS al 10% e centrifugare (10 min a 500xg); Scartare il sopranatante (sul fondo del tubo è visibile il pellet, composto dalle cellule sedimentate); Aggiungere al sedimento una piccola quantità (circa 1 ml) di DMEM + FBS al 10% per effettuare una risospensione graduale delle cellule; aggiungere altro DMEM + FBS al 10% fino a raggiungere il volume desiderato. Prelevare un certo volume di sospensione cellulare e seminare in fiasca; il volume di sospensione cellulare da seminare dipende dalla superficie di crescita della fiasca e dalla densità desiderata.

La conta cellulare La conta cellulare è importante per monitorare la crescita cellulare (curva di crescita) in vitro e per seminare le cellule nella corretta densità.

La conta cellulare Un metodo semplice ed economico è l’uso dell’emocitometro L’ emocitometro : consistente in un vetrino portaoggetti recante al centro una depressione in cui è incisa una minutissima quadrettatura. L’emocitometro serve per determinare il numero di cellule per unità di volume di un liquido. Le cellule sono visivamente contate per mezzo di un microscopio ottico.

Il solco centrale (camera principale) ha due set di reticoli incisi per il conteggio,separati da un canale. La camera principale nel canale centrale è più bassa di 0,1 mm (profondità della camera), rispetto agli altri due canali esterni. Per cui, quando un vetrino coprioggetto è posto sopra, c’è una differenza di 0,1 mm tra il vetro e la camera centrale. Burker Neubauer Thoma

IL RETICOLO DELLA CAMERA DI BURKER Nell'area di 9mm² nello spessore della camera di Burker è disegnato un reticolo ed è all‘interno di questo che verranno contate le cellule sfruttando un riferimento spaziale preciso. Lo spessore compreso fra il vetrino copri oggetto e la camera contacellule è pari a 1/10 di mm (0,1mm) . Per cui il volume sarà 1/10 di mm³ = 0,1 mm³ =10-1 mm³

Il reticolo della camera di Burker è fondamentalmente strutturato in nove quadrati delimitati da tre righe parallele con all'interno quadrati e rettangoli delimitati da due righe parallele. V = 0,1mm3

Una volta riempito per capillarità il sottile spazio fra coprioggetto e camera, potrò contare le cellule riconoscendole come sfere più o meno rifrangenti a seconda del variare della regolazione del fuoco del microscopio. In teoria potrei limitarmi a contare le cellule in uno solo dei 9 quadrati grandi, moltiplicarne il numero per 10 (porto al mm³) e poi moltiplicare per il fattore di diluizione. Ma la distribuzione delle cellule può non essere perfettamente omogenea quindi...

...è consigliabile contare le cellule in 4 quadrati e calcolare la media: in questo modo si riduce il margine di errore. In sintesi il sistema per contare le cellule all'interno del reticolo della camera di Burker prevede: 1) contare le cellule nei 4 quadrati grandi disposti a Y (ricordandosi di non considerare quelli all'interno delle 3 righe di confine su due soli lati): esempio 84 2) calcolare la media: esempio 84:4=21 3) 21 in 0,1mm3 4) Moltiplicando per 104 ottengo il numero di cellule in un cm3 1 cm3 = 1ml 21 x 104 cellule per ml

...se le cellule sono state risospese in 5ml di terreno quante cellule avrò in totale? 21 x 104 cellule : 1 ml = X : 5ml 21 x 104 cellule / ml X 5ml X= = 105 x 104 cellule totali

Conta vitale delle cellule: Test di esclusione del colorante Trypan Blue Il metodo del trypan blue permette di verificare la funzionalità e la permeabilità della membrana plasmatica in quanto questo colorante non attraversa la membrane delle cellule vitali, mentre attraversa quella delle cellule danneggiate colorando il citoplasma di blu. Le cellule colorate in blu possono essere distinte e contate per mezzo di una camera di conta al microscopio. I risultati saranno espressi come percentuale di cellule vive Si impiega in genere una soluzione allo 0,1%- 0,2% di Trypan Blue in soluzione fisiologica, con l’accorgimento di diluire la sospensione delle cellule con tale soluzione in rapporti fissi (1:1 o 1:2)

Conta vitale delle cellule: Test di esclusione del colorante Trypan Blue Supponiamo di contare 25 cellule e che 4 di queste cellule presentino il typan blue nel citoplasma, le cellule vive saranno: 21 x 104, mentre le cellule morte saranno 4 x 104 Se abbiamo diluito delle cellule con un rapporto 1:1 21 x 104 x 2 Fattore di diluizione 4 x 104 x 2

Se abbiamo diluito delle cellule con un rapporto 1:1 Conta vitale delle cellule: Test di esclusione del colorante Trypan Blue Se abbiamo diluito delle cellule con un rapporto 1:1 21 x 104 x 2 / ml 4 x 104 x 2 / ml vitalità cellulare (V)= N° di cell. vive/N° di cell. vive + N° di cell. Morte = 21x104 / 21x104 + 4x104 = 0,84x 100 = 84%

La camera di NEUBAUER Il modello più utilizzato ed attuale La profondità della camera è di 0,1 mm. Il reticolo mostra 9 larghi quadrati ciascuno di 1 mm2. I 4 larghi quadrati agli angoli (indicati da una "L") sono suddivisi in altri 16 quadrati, con lati da 0,25 mm. Il largo quadrato centrale è suddiviso in 25 quadrati con lati da 0,2 mm. Ogni gruppo di quadrati contiene 16 mini quadrati con lati da 0,5 mm ognuno con un area di 0,0025 mm2. L L L L

Conta Cellulare con NEUBAUER (0.100 mm) Diversamente dalla classica conta in camera di Burker, la camera NEUBAUER si propone di ottimizzare i tempi della conta infatti, vista al microscopio ottico, essa è formata da soli 4 quadrati grandi delimitati da linee triple, ognuno dei quali formato da ulteriori 16 quadrati più piccoli. Noi andremo a contare le cellule contenute nei 4 quadrati grandi più quelle presenti su due lati contigui di ogni quadrato (nella figura sono segnati in rosso; la scelta dei lati contigui è SOGGETTIVA). Effettuata la conta come sopra descritto, il numero di cellule per ml e il totale di cellule si ottiene secondo le seguenti formule: - cellule/ml= A+B+C+D/4 x 10^4** x 2 - celluleTOT= cellule/ml x Volume Finale

CRIOCONSERVAZIONE Riduce il rischio di contaminazioni microbiche. Riduce il rischio di deriva genetica e di cambiamenti morfologici Permette di avere a disposizione una batteria di cellule allo stesso numero di passaggi Riduce i costi

CRIOCONSERVAZIONE Nome della linea cellulare Provenienza Posizione nel contenitore di azoto liquido Data di congelamento Numero di ampolle congelate

CRIOCONSERVAZIONE Le cellule vengono congelate durante la fase logaritmica o appena raggiunta la confluenza Le cellule devo essere congelate in presenza di terreno di crescita e agenti crioprotettivi come il DMSO o il glicerolo che prevengono la formazione di cristalli di ghiaccio durante l’abbassamento della temperatura.

CRIOCONSERVAZIONE Protocollo Crescere le cellule per il congelamento in numero sufficiente da poter congelare (2-5 milioni di cellule per ampolla Lavare ogni piastra con una quantità di sufficiente di PBS a coprire l’intera superficie Staccare le cellule con tripsina Effettuere una conta vitale Centrifugare le cellule 10 min a 500g Risospendere le cellule con terreno per il congelamento 2-5 milioni per ml (durante questa operazione le cellule devo essere messe in ghiaccio) Aliquotare 1 ml in agni ampolla Chiudere accuratamente i tappi Marcare le ampolle con pennarelli indelebili Sistemere le ampolleavvolte in cotone in una piccola scatola di polistirolo porre il tutto in un congelatore a -80°C per almeni 10-15 ore Trasferire le cellule nel contenitore dell’azoto

Terreni di congelamento CRIOCONSERVAZIONE Terreni di congelamento 90% Siero, 10% DMSO 90% di Terreno con siero al 50%, 10%DMSO

Espansione della coltura Nuova linea cellulare Abbandonare il congelamento Test micoplasma + Quarantena Principale camera di coltura Espansione della coltura Crioconservazione 10-100 vials Conta cellulare/ vitalità Test micoplasma Caratterizzazione Non riuscito Ripetere il banking Congelamento