STRUTTURE DI MACROMOLECOLE & BANCHE DATI STRUTTURALI

Proteine  Fold globinico Fascio di eliche

Proteine  Barrel  antiparalleli

Proteine   barrel

Conoscere la STRUTTURA TRIDIMENSIONALE di una PROTEINA o di qualsiasi altra MACROMOLECOLA: conoscere la posizione nello spazio (COORDINATE) di tutti gli atomi della molecola

Cristallografia a RAGGI X: -Bombardamento di cristalli della proteina con raggi -Gli atomi pesanti (C,O,N,S,P,Cl,Metalli, ecc.) diffrangono i raggi X -Gli idrogeni non sono visibili -Nessun limite alle dimensioni della proteina NMR (Risonanza Magnetica Nucleare): -Bombardamento di soluzioni della proteina con radiofrequenze in presenza di campi magnetici -Gli idrogeni sono visibili -Solo proteine piccole (max aa)

Proteina Solubile Buffer di cristallizzazione: alta forza ionica + ioni e molecole che favoriscono l’“avvicinamento” delle molecole proteiche (polietileneglicole, zuccheri, glicerolo, solfati, fosfati, acetati, ecc.). Cristallografia a Raggi X Le proteine vengono poste in condizioni tali da formare cristalli proteici

Cella Elementare Contatti molecolari principali

Altri contatti molecolari Cristallo Proteico Cavità e canali riempite dal solvente, ioni e molecole del buffer di cristallizazione

fori

Onde diffratte Pattern di diffrazione fori Sorgente

Onde diffratte Sorgente Raggi X Molecola

Onde diffratte Sorgente Raggi X Pattern di diffrazione Cristallo

Mappa di densità elettronica

Ioni di Metalli pesanti (Hg, Cd, Zn ecc.)

CH 3 | S | CH 2 | CH 2 | Met CH 3 | Se | CH 2 | CH 2 | SeMet metioninaSeleno-metionina

N S protone Risonanza Magnetica Nucleare NMR

E1E2 H0H0 E2 > E1  E = (E2 – E1) = h*

E  E’ = (E2’ – E1’) = h* ’ E2 E1 H0H0 H’ E1’ E2’

R H H0H0 H0H0

H H 3 C H Cl 3 C H O H -C H O

H 3 C Si CH 3 CH 3 Tetrametil-Silano ++ -- -- -- --

C Cl H HH 1,1,2-tricloro-etano H0H0

C Cl H HH 1,1,2-tricloro-etano H0H0

C Cl H HH 1,1,2-tricloro-etano H0H0

C Cl H HH H0H0

C Cl H HH H0H0

H H H H H H H H | | | | | | | | -N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C- | || | || | || | || R O R O R O R O

H 2 C H H CH 2 < 5 Å Nuclear Overahauser Effect

L’NMR fornisce una lista di coppie di idrogeni posti a distanze di 2-5 Å. Queste informazioni sono definite “vincoli” La struttura viene dedotta da questa lista attraverso dei programmi che cercano quali strutture soddisfano tutti i vincoli determinati sperimentalmente. Spesso più strutture alternative (anche se in genere molto simili) soddisfano i vincoli pertanto l’NMR fornisce un “set” di strutture simili piuttosto che un’unica struttura. Meno numerosi sono i vincoli più numerose saranno le strutture alternative.

Altri nuclei danno segnale NMR, in particolare 13 C e 15 N. Questi nuclei possono essere usati per migliorare la definizione di una struttura NMR (ridurre il numero di strutture alternative) Poiché l’abbondanza naturale di 13 C e 15 N è solitamente troppo bassa si devono preparare proteine “marcate” con questi isotopi facendo crescere le cellule che producono la proteina/molecola di interesse in un terreno di coltura contenente fonti di carbonio e azoto marcati (ad esempio amminoacidi o nucleotidi marcati con 13 C e 15 N).

Protein Data Bank (PDB) Contiene tutte le strutture cristallografiche e NMR note Liberamente accessibili in Internet all’indirizzo Ogni struttura è conservata sotto forma di un file (detto file PDB, estensioni.pdb oppure.ent) che contiene la lista di coordinate spaziali di tutti gli atomi della proteina

Ad ogni file PDB (quindi ad ogni struttura) viene assegnato un codice identificativo di 4 caratteri - il “codice PDB” - di forma generale: # §§§ dove # = numero da 0 a 9 § = numero da 0 a 9 oppure lettera alfabeto inglese 1ONC 1BSR 1A2W 1KW6 1Q0C 11CY ….

La lista di coordinate nel file PDB viene trasformata in una rappresentazione tridimensionale mediante programmi noti come “programmi per la grafica molecolare” Due dei più noti programmi per la visualizzazione dei file PDB sono: Swiss PDBviewer (SPDBV, DeepView) liberamente ottenibile all’indirizzo PyMol liberamente ottenibile all’indirizzo (solo fino alla versione 0.99-rc6)

Swiss PDBviewer e PyMol consentono di: - Trasformare la lista di coordinate della macromolecola in una visualizzazione tridimensionale - Cambiare il tipo di visualizzazione per evidenziare proprietà e caratteristiche differenti - Selezionare parti della macromolecola su cui agire - Salvare la rappresentazione corrente in modo da non dover ripetere il lavoro in una sessione successiva - Salvare immagini bidimensionali in formati standard come.jpg e.bmp da inserire in file word, powerpoint, ecc.