RIGENERAZIONE DEL TESSUTO OSSEO

Periostio. Lamina di connettivo fibroso a fasci intrecciati Disco epifisi. Disco di cartiligine che si converte in osso in modo da assicurare una crescita in lunghezza dell’osso Osso spugnoso. Strati lamelle associate in trabecole che delimitano le cavità midollari Osso compatto. Organizzazione di canalicoli concentrici intorno a canali più grandi (canale di Havers) attraverso i quali passano sistemi di irrorazione. Midollo osseo. Contiene cellule staminali

ISTOGENESI DELL’OSSO Ossificazione diretta o membranosa: ossa piatte della volta cranica e del massiccio facciale Ossificazione mantellare: corpo della mandibola Ossificazione indiretta o condrale: ossa dello scheletro assile, degli arti e della base del cranio ossificazione pericondrale: l’osso si forma sulla superficie dell’abbozzo cartilagineo ossificazione endocondrale: l’osso si forma all’interno dell’abbozzo cartilagineo

OSSIFICAZIONE ENDOCONDRALE

OSSIFICAZIONE ENDOCONDRALE

A: Condensation of MSCs B: Differentiation into chondrocytes C: Hypertrophic condrocytes formation D: Vascular invasion E: Bone remodeling F: Secondary ossification centers G: Proliferating chondrocytes

MATRICE OSSEA Fibre connettivali: sono rappresentate per la quasi totalità da fibre collagene (Type I) Proteoglicani (PG-I-II) Glicoproteine: osteonectina, fosfatasi alcalina, fibronectina Sialoproteine o BSP: ostepontina (BSP-I), glicoproteina acida dell’osso (BAG-75) Proteine con acido g-carbossiglutammico (GLA): osteocalcina Componente minerale (50%): cristalli di sali di calcio, prevalentemente fosfato di calcio

FRATTURA DELL’OSSO Interruzione dell’architettura ossea Lacerazione del periostio Rottura del circolo endostale

CONDIZIONI CHE RALLENTANO O IMPEDISCONO LA GUARIGIONE DI UNA FRATTURA: Diabete Insufficienza Renale Osteoporosi Malattia Di Paget Infezioni Ossee Tumori Esiti Di Radioterapie

INGEGNERIA DEI TESSUTI L’ingegneria dei Tessuti è una tecnologia che mira allo sviluppo di sostituti biologici per il riparo, mantenimento, o rigenerazione

Rigenerazione e riparo La rigenerazione di tessuti o organi non è vietata da nessun principio biologico. Infatti la rigenerazione è il meccanismo di recupero predominante per talune specie animali ed in tessuti embrionali. Purtroppo organismi superiori hanno perso tale capacità e presentano il solo riparo per di piccole lesioni. Lucertola Salamandra

Realizzazione di bioibridi tessutali Realizzazione costrutto cellulare Coltura cellulare 3D Sviluppo di tessuti in vitro Cellule primarie Isolate dalla biopsia Impianto Del tessuto biopsia Realizzazione di bioibridi tessutali In vitro TE Paziente Espansione Impianto In situ TE Realizzazione costrutto cellulare Coltura cellulare in 2D Semina delle cellule nello scaffold 3D

Tessuti ingegnerizzati pelle (il primo tessuto ingegnerizzato commercializzato) cartilagine ossa pancreas vasi valvole cardiache vescica cornea nervi legamenti ferite croniche

INGEGNERIA DEI TESSUTI

L’ingegneria dei tessuti è un campo multidisciplinare L’ingegneria dei tessuti si basa sulle conoscenze di : biologia cellulare, biochimica e biologia molecolare; scienza dei materiali, ingegneria chimica e bioingegneria; medicina e chirurgia e le applica all’ingegnerizzazione di nuovi tessuti. Sometimes also called now “regenerative medicine”. Emphasize last sentence.

Elementi dell’ingegneria dei tessuti cellule materiale o “scaffold” microambiente tessuto equivalente

Requirement of a TE Scaffold Controlled degradation rate Degradate Adhesion Growth Cell guidance Differentiation IDEAL SCAFFOLD Migration Microstructure properties: porosity degree, pore shape, dimension and interconnectivity Nutrient supply StructuralSupport Sustain mechanical loading during new tissue growth

Produzione di scaffolds piattaforme naturali Derivati dell’acido ialuronico nonwoven gels sponges tubes Collagene e collagene-glicosaminoglicani copolimeri membranes sponges gels

Produzione di scaffolds piattaforme sintetiche Membrane porose e fibre di PLLA, PGA, PEGT/PGP PLLA fabric PGA bonded fibres PEGT/PGP Materiali basati su idrossiapatite e fosfato di calcio Hydroxyapatite, Hyaff11/CaP Composite

(collagene, acido ialuronico,...) “SCAFFOLD” POLIMERICI Materiali naturali (collagene, acido ialuronico,...) Vantaggio: contengono gli adeguati segnali biochimici responsabili dell’induzione nelle cellule dell’espressione di un specifico programma tessuto-specifico Materiali sintetici (PLLA, PGA, PEG, ...) Vantaggio: proprietà quali resistenza, velocità di degradazione, microstruttura, permeabilità sono controllate durante la loro produzione Il supporto polimerico (naturale o sintetico) è/deve essere disegnato in modo da favorire la crescita e differenziazione delle cellule in un appropriato ambiente tridimensionale, funziona da supporto meccanico temporaneo che va scomparendo mano mano che il tessuto si rigenera. Esso può essere costituito da un materiale naturale o sintetico Materiali bioattivi

Design of Bioactive Materials presentation of biological signals ECM molecules Focal adhesion Soluble factors We are beginning to learn a new language- a language with an alphabet made out of molecules (protein) and very complex syntax whose grammar is still unknown- as today we just know very few words (kalispera, kalimera, parakalo) and we do not go very far with those but especially you young and fresh minds will have a change to full discover this fascinating language- Biology, as science, has the role to ‘read’ this language and engineer has the role to ‘speak’ this language – therefore biology and engineer sciences have to be integrated- not just multidisciplinar but INTEGRATED Cells in the context

3D, Angiogenesis, and Tissue Engineering

Stimulation and control of angiogenesis and vasculogenesis are critical for tissue engineering to succeed

Strategies for enhancing vascularization Advantages: • Easy to engineer • High-quality vessels Vascularization by host Disadvantage: • Too slow G F Advantage: • Immediate perfusion Disadvantages: • Hard to engineer • Must be compatible with blood Nutritive medium Engineered vascular network Host vein Host artery Robert Vernon

Which pore size is most important? Role of pore size and pore size distribution on scaffold vascularization Which pore size is most important? Characteristic of most tissue engineering scaffolds: A broad distribution of pore sizes and pore shapes ranging from very small to very large.

Porous pHEMA templated with crystalline array of 60µm beads Marshall, AJ,

Marshall, AJ,

Extend of material vascularization Vascular Density depth profile Marshall, AJ,

Pore size and vascularization Spherical pore diameter (µm) Intra-Pore Vascular Density in Outer 200 µm of Implant

How can we get better blood vessels?

Cytokine delivery from scaffolds * Induction of vascularization in TE scaffolds • Dual growth factor delivery from degradable scaffolds for de novo blood vessel synthesis Fabrication process: o PDGF encapsulated in PLGA microspheres by double emulsion approach o Microspheres (5-50 μm) mixed with PLGA particles (150-250 μm), NaCl particles (250-500 μm), and lyophilized VEGF particles (5-50 μm) in mold and compression molded to form a solid disk o Disk equilibrated with CO2 at 800 psi 48hrs o Pressure rapidly dropped to ambient (14 psi) o Salt leached by soaking in distilled water 48 hrs Richardson et al., Nature 2001

of immature blood vessel formation Induction of mature blood vessel Cytokine delivery from scaffolds ** The sequential delivery of VEGF and PDGF-BB using a controlled release polymeric device subcutaneously and in a hind limb ischmia model induced a mature new vascular network with vessels having a thick coat of smooth muscle cells. Induction of immature blood vessel formation VEGF The dual cytokines controlled release induces formation of more stable blood vessels with larger diameters Questo sistema polimerico …consente un rilascio sostenuto di due GF che intervengono in due fasi distinte del processo angiogenico, e nel contempo preserva la funzionalità biologica dei fattori. Nel primo approccio il VEGF liofilizzato viene disciolto con le particelle del polimero prima di processare il polimero per ottenere uno scaffold poroso.Con questo approccio si ottiene un rilascio immediato (veloce di VEGF che si mantiene sostenuto per la prima fase. Il secondo approccio prevede il preincapsulamento di un altro fattore il PDGF-BB (che invece interviene della fase di maturazione del vaso) in microbiglie dello stesso polimero, prima di processare il polimero.in questo modo si ottiene un rilascio ritardato di questo fattore. Il III approccio combina i due precedenti, miscelando particelle di polimero VEGF e microsfere incorporanti PDGF-BB, prima del processo. In tal modo rilascio multiplo di fattori con cinetiche di rilascio distinte.VEGF 80 nG/day per I primi 7gg Nelle istologie staining per alfa actina SMC (marrone) VEGF induce un aumento dei vasi che però non sono maturi (assenza di coloroazione) PDGF-BB non induce aumento della densità dei vasi, seppure induce un aumento della maturazione di quelli preesistenti (colorazione marrone) Insieme: These authors showed that by controlling relese of growth factors by acellular scaffold it is possible to modulate theingrowth of stable capillary. In particular, by releasing singularly VEGF and PDGF does not lead to a stable capillary network albeit there is a xxxxxx respect to the blank control. An enahncement of capillary matruration and stability is observed when the two factor are released in a controlled and temporal sincronized fashion. The vascular bed was stable for 2 weeks. VEGF+PDGF Drawback Induction of mature blood vessel The infiltration of host endothelial cells into the construct took more than two weeks in this model,which may limit the size of such tissue constructs PDGF Richardson et al., Nature 2001

Scaffold design by microparticle assembly Microparticles preparation SINGLE EMULSION Preparation of porous or non porous microspheres by using water soluble (W/O) or water insoluble (O/W) polymers DOUBLE EMULSION Preparation of porous microspheres, loaded with bioactive factors, by using water soluble (W/O/W) or water insoluble (O/W/O) polymers Sintering/ Printing Holes Bioactive factors Design toolbox to prepare scaffolds with defined porosity, interconnectivity degree, mechanical properties and time and space distribution of bioagents CASD/CASM A. Luciani, et al.,. Biomaterials, 2008

Single emulsion (O/W) PCL microspheres obtained by PCL-methylenchloryde (O) in polyvinylalcohol-water (W) emulsion 24/76 PCL/MC (w/v) 400 rpm 08/92 PCL/MC (w/v) 400 rpm

Double emulsion (W/O/W) PCL microspheres loaded with BSA prepared by W/O/W double emulsion: PBS/PVA/BSA (W) in PCL/MC (O) Second emulsion in PBS/PVA (W) 1,7 % PCL 3 % PCL 1 % PVA 0,5 % PVA 0,05 % PVA

Protein-free microspheres Protein-loaded microspheres Sintered scaffold preparation Heating or Solvent Porosity Protein-free Matrices Protein-free microspheres 500 ÷ 630 μm 300 ÷ 500 μm Samples Protein-loaded Matrices Protein-free microspheres (300 ÷ 500 μm) + Protein-loaded microspheres (50 ÷ 180 μm)

Morphology of sintered scaffold T=61°C t=1h

Morphology of sintered bioactive scaffold Protein Distribution

FORMATION OF BONE TISSUE IN VIVO X-ray control 60 days after the implant Savarino et al. Biomaterials 2007

Microspheres Sintering Advantages Total interconnected porosity High mechanical properties Possibility to include bioactive signals Sintered Scaffold Sintering Microspheres Preparation Single Emulsion Double

Microspheres Sintering: S.E.M. 24/76 PCL/MC (w/v) 400 rpm 08/92 PCL/MC (w/v) 400 rpm

Double emulsion: Microstructural S.E.M. 0,05 % PVA 0,5 % PVA 1 % PVA 1,7% PCL

Stem cells Single-cell Embryo 3-day Embryo 5-7 day Embryo 4-week Embryo Human Developmental Continuum Embryonic Stem (ES) cells Totipotent 6-week Embryo Embryonic Germ (EG) cells (primordial germ cells) Pluripotent Fetal Tissue Stem cells or Multipotent Adult “Adult” Stem cells Pluripotent or Multipotent Embryonal Carcinoma (EC) cells Teratocarcinoma (germ cell tumor) Cord Blood Stem cells Placental Stem cells Pluripotent or Multipotent Infant

LE CELLULE EMBRIONALI STAMINALI 51

GASTRULATION FUNCTIONAL SIGNIFICANCE

ES CELL DIFFERENTIATION

MESENCHYMAL STEM CELLS Candidati ideali per ingegneria tissutale Multipotenti Coltivabili in vitro Non immunogeniche Candidati ideali per ingegneria tissutale

AGENTI OSTEOINDUTTIVI Proteine morfogenetiche dell’osso (BMPs): Fattori di crescita appartenenti alla superfamiglia TGFB Esistono più di 30 forme di BMPs ma le più studiate sono le BMPs 1-7 Promuovono la differenziazione di cellule multipotenti verso linee di tipo osteoblastico

BMPs signaling pathways BMPs signaling pathways. BMPs ligands bind to type I and type II simultaneously, after the phosphorylation, type I receptors recruit R-Smads, and this leads to activation of the Smad-dependent pathway. Activation and translocation of R-Smads assisted by Co-Smad result in transcriptional regulation of target genes. If BMP ligands bind to the type I receptors first and then recruit the type II receptors, following phosphorylation by type II receptors, the type I receptors activate TAB1/2/3 through XIAP, which finally activate MAPK pathways, leading to the activation of Smad independent pathway

BMP NETWORK

FATTORI DI TRASCRIZIONE OSTEOGENICI Runx-2: membro della famiglia Runt domain un dei maggiori regolatori del differenziamento osteoblastico necessario ma non sufficiente per una appropriata osteogenesi regola l’espressione di geni osteoblast-specific: osteocalcina, osteopontina, sialoproteine Osterix: fattore di trascrizione zing-finger è richiesto per la differenziazione completa terminale in osteoblasti

FATTORI DI TRASCRIZIONE OSTEOGENICI Msx2: promuove il potenziale osteogenico Dlx5: indispensabile regolatore del differenziamento osteogenico inquanto induce sia l’espressione di Runx2 che di Osterix dopo stimolazione da BMP

SIGNALING AND TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF OSTEOBLAST DIFFERENTIATION

STRATEGIE DI RILASCIO DEL FATTORE OSTEOINDUTTIVO approccio ex-vivo le cellule sono rimosse dall’individuo, modificate geneticamente e reintrodotte nel sito di frattura. approccio in vivo introduzione diretta nel sito di frattura.

ANALISI IN VITRO Produzione ed espressione di BMPs Espressione di markers di differenziamento osteoblastico (fosfatasi alcalina, collagene I, osteopontina, osteonectina…) Colorazioni istochimiche (alizarin red s, von Kossa..)

ANALISI IN VIVO Produzione di osso ectopico Riparo in modelli di frattura

A B C D week 1 week 2 week 3 week 4 FG-B4TK FG-B4 FG-B4TK FG-B4

A B FG-B4TK FG-B4 FG-B4TK FG-B4 T0 T28 C D

A B C D dx dx sn sn sn sn

A B C D dx dx dx dx sn sn sn sn

A B C D dx dx dx dx sn sn sn sn

REPROGRAMMING Generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from somatic cells Reproducible procedures Good source of pluripotent cells No ethical issues

REPROGRAMMING BASIC PROCEDURES

MOLECULAR EVENTS DURING REPROGRAMMING

CHARACTERISTICS OF HUMAN iPS Expression of NANOG, OCT4, SOX2 and telomerase and upregulation of SSEA1 Downregulation of THY1 ALP+ Reactivation of silent X and epigenetic changes in relevant promoters Functional testing

iPS vs. ES iPS are less prone to teratoma formation Cells of origin causes differences in potency Both cells show tendency to chromosomal aberrations, CNVs accumulations, and several mutations Methylation profiles depend on iPS cell of origin Differences affects utility

METHODOLOGICAL ISSUES ON THE GENERATION OF iPS Choice of reprogramming factors Methods of factors delivery Choice of cell type Parameters of factors expression Culture and derivation conditions Identification of reprogrammed cells Expansion and characterization of iPS Final tissue characterization

DIRECT REPROGRAMMING

Rigenerazione cardiaca: Direct Reprogramming ed Induced Pluripotent Stem cells

DIRECT REPROGRAMMING IN VIVO REDUCES SCAR AREA

DIRECT REPROGRAMMING IN VIVO IMPROVES VENTRICULAR FUNCTION

Cell sheet Engineering Build up tissues from cell layers A concept pioneered by Prof. T. Okano Cardiac patch Periodontal ligament Corneal epithelium Lung puncture repair Esophageal repair Culture cells on a thermoresponsive polymer 37°C 25°C Canavan, H.E., et al. (2005) Surface characterization of the extracellular matrix remaining after cell detachment from a thermoresponsive polymer. Langmuir 21, 1949-1955

Tissue delivery using microcarriers Strategy description Microcarriers Pretissue monolayer Self-assembly Cells Pretissue microspheres

complex tissues may be engineered by heterogenous pre-tissue Tissue delivery using microcarriers Different Cells types Microcarriers complex tissues may be engineered by heterogenous pre-tissue

Tissue reconstruction from cell-seeded microbeads Tissue reshape can be obtained by bolus injection of cell seeded microbeads at the site of injury Not need to know previously disease shape