Caratteristiche generali I biosensori sono sistemi biochimico-fisici costituiti da mediatori biologici, anche viventi, immobilizzati secondo particolari schemi operativi ed accoppiati ad idonei trasduttori di segnale capaci di registrare, selettivamente e reversibilmente, la concentrazione o l'attività di analiti diversi presenti nel campione [Briggs J., Scheller F., Schubert F.,1992].

Biosensori Metodi rapidi, sensibili ed economici per monitoraggi e analisi accurate rappresentano un’esigenza sempre più avvertita negli ultimi anni. I biosensori si propongono come soluzione efficace e promettente, combinando i vantaggi della specificità e della sensibilità dei sistemi biologici con la risposta quantitativa e veloce degli strumenti elettrochimici. vede in prima linea Giappone, USA e, in Europa, Germania e Inghilterra. L'attività brevettuale del Giappone sui biosensori e sulle loro componenti dimostra chiaramente quali siano le vaste possibilità di applicazione e le prevedibili ricadute economiche di questa tecnologia

L'intensa attività di ricerca nel campo dei biosensori su scala mondiale mira a vari obiettivi, quali lo svilupppo di nunove concezioni di trsduttori, l'uso di nuovi sistemi biologici, l'ampliamento dei campi di applicazione per il monitoraggio di sostenze pericolose per l'ambiente e per la determinazione di svariati composti in settori che vanno dalla medicina alle biotecnologie, alla farmacia e al settore agroalimentare. i l funzionamento dei biosensori si basa fondamentalmente sulla biotrasformazione specifica di substrati che, attraverso reazioni ossido-riduttive, determinano un flusso di elettroni rilevabile mediante un apposito trasduttore di tipo elettrochimico. La risposta del trasduttore viene convertita in un segnale elettronico che è proporzionale alla concentrazione del substrato. Per la costruzione di biosensori possono essere utilizzati diversi tipi di sistemi biologici, quali enzimi, microorganismi, recettori cellulari, immunoproteine, acidi nucleici.

Grazie alla loro specificità, normalmente rendono superfluo il pre-trattamento del campione e l'utilizzo di reagenti altri dalla soluzione tampone. l'analisi richiede poco tempo, più affidabile più economica. alta sensibilità permette di rilevare anche basse concentrazioni di una sostanza Con attrezzature adeguate è possibile sviluppare una gamma di biosensori diversi, come per esempio un formato tascabile da utilizzarsi a casa o all'aperto, biosensori con testa di misura "usa e getta", biosensori a risposta rapida che, rispondendo dopo secondi, consentono un monitoraggio quasi continuo oppure, mediante un collegamento con opportuni sistemi di campionamento, rendono possibile processare centinaia di campioni all'ora a costi molto contenuti.

I biosensori sono sensori molecolari che combinano un meccanismo di riconoscimento di tipo biologico con un dispositivo tecnico di trasduzione del segnale, solitamente di tipo fisico.

il mediatore biologico immobilizzato sulla superficie del sensore prende parte ad uno o più processi che determinano la variazione di un parametro chimico, fisico o chimico-fisico, il quale viene prontamente rivelato dal trasduttore di segnale, che lo converte in un segnale elettrico, a sua volta amplificato, elaborato e visualizzato.

Campione: Mediatore:Trasduttore:Segnale Sangue Urine Alimenti Ambiente Enzimi Anticorpi Recettori Elettrochimico Ottico Calorimetrico Acustico Corrente, Potenziale Conducibilità Assorbanza Temperatura Frequenza A type of biomolecular probe that measures the presence or concentration of biological molecules, biological structures, etc., by translating a biochemical interaction at the probe surface into a quantifiable physical signal such as light or electric pulse. biospecimen - Sample taken from a patient such as blood, tissue, urine, or sputum.

- biosensori biocatalitici o sensori enzimatici; - biosensori chemorecettoriali o sensori a recettore; -biosensori immunologici o immunosensori, ossia biosensori basati sulle interazioni antigene -anticorpo. - I mediatori biologici possono essere enzimi, recettori, anticorpi monoclonali e policlonali, microrganismi viventi, materiali diversi provenienti da tessuti animali e vegetali o in qualche caso organi intatti [Rechnitz,1979. Rechnitz Rechnitz 1993] i biosensori vengono classificati sia in base alla natura del mediatore biologico sia in base al tipo di trasduzione impiegata.

Mediatori biologiciVantaggiSvantaggi Biocatalizzatori Enzimi singoliAlta selettività, alta attivitàDisponibilità e stabilità limitate Sequenze polienzimatiche Altissima versatilitàSoggetti ad interferenze; ristrette condizioni sperimentali di impiego Ceppi di microoganismi Vasto assortimento, totale autonomia, possibilità di rigenerazione Bassa selettività, tempo di vita limitato Tessuti interi (animali o vegetali) Alta attività, condizioni naturali di impiego del biocatalizzatore, costi di produzione minimizzati Soggetti ad interferenze e/o contaminazione, tempo di vita limitato

Mediatori Agenti immunologici vantaggi Svantaggi Anticorpi policlonaliRelativamente poco costosiSelettività limitata, presenza di diverse costanti di binding Anticorpi monoclonaliOttima selettività, costanti di binding uniformi Costi elevati, disponibilità limitata Frammenti anticorpaliBasso peso molecolareCosti variabili, disponibilità limitata Coniugati immunoenzimatici Altissima sensibilitàLaboriose operazioni di preparazione Anticorpi marcatiAltissima sensibilitàDifficoltà di preparazione Anticorpi cataliticiAltisssima sensibilità e specificitàDifficoltà di preparazione, costi elevati Chemorecettori Strutture intatteImpiego nelle migliori condizioniFragilità, tempo di vita limitato Chemorecettori isolatiSensibilità maggiore, possibilità di preparazione al momento dell'impiego Difficoltà di conservazione, scarsa disponibilità, selettività limitata

In base al tipo di trasduttore di segnale si può operare una distinzione tra: - biosensori elettrochimici o bioelettrodi; - biosensori ottici o bio-optrodi; - biosensori calorimetrici o biotermistori; - biosensori acustici

Immobilizzazione enzimatica numerose tecniche di immobilizzazione dei mediatori biologici la scelta risulta particolarmente importante quando si tratta degli enzimi, data la loro solubilità in mezzo acquoso [Palleschi G.,1989]. la tecnica utilizzata è scelta in base alle caratteristiche dell'enzima poichè i procedimenti di immobilizzazione possono provocare vari inconvenienti, come la modifica della struttura, delle caratteristiche e del comportamento catalitico dell'enzima, con riduzione o anche perdita dell'attività enzimatica Da un punto di vista generale le procedure di immobilizzazione degli enzimi possono essere raggruppate in due categorie: A) immobilizzazioni fisiche in cui l’enzima è semplicemente trattenuto dal supporto ; B) immobilizzazioni chimiche in cui l’enzima è legato covalentemente al supporto.

: Schema delle tecniche per l’immobilizzazione di enzimi.

Tecniche di immobilizzazione Immobilizzazione fisica Immobilizzazione chimica

1)Immobilizzazioni fisiche: a) Intrappolamento su gel e incapsulamento: le molecole di enzima vengono a trovarsi all'interno di un gel o di una membrana polimerica.. Il polimero deve essere impermeabile all'enzima in modo da impedirne la fuoriuscita, ma allo stesso tempo deve permettere il passaggio dei substrati. b) Adsorbimento: l'enzima è trattenuto sul supporto da legami elettrostatici (ionici, dipolari) e da legami idrogeno. 2) Immobilizzazioni chimiche: a) Reticolazione tra l'enzima e macromolecole naturali o sintetiche tramite reagenti bifunzionali. b) Legame covalente tra l'enzima e il supporto insolubile direttamente o tramite una molecola spaziatrice.

Tabella:Supporti insolubili utilizzati per l’immobilizzazione chimica di enzimi Supporti PoliacrilammideCollagene Acido poliacrilicoPolivinil alcool CarbossimetilcellulosaVetro poroso Acido poliasparticoPolistirene CellulosaSepharose Acido poliglutammicoSephadex Nylon Polimeri Biocompatibili PoliuretaniAcetato di cellulosa Acrilonitrile In genere i residui degli aminoacidi adatti alle reazioni di accoppiamento sono i gruppi amminici in a e in e della lisina, l’anello fenolico della tirosina, i gruppi carbossilici in b dell’acido glutammico e dell’acido aspartico, il gruppo sulfidrilico della cisteina e il gruppo imidazolico dell’istidina [Palleschi G.,1989].

MEMBRANE si usano per preparare un elettrodo ad enzima Nel caso dell’elettrodo ad ossigeno (elettrodo di Clark) la membrana a gas è un’eccellente protezione per l’elettrodo di lavoro e per l’elettrodo di riferimento da sostanze interferenti di varia natura, cioè da composti elettroattivi che darebbero, se arrivassero all’elettrodo di lavoro, un segnale elettrico che falserebbe la misura in esame. Le membrane da dialisi permettono il passaggio di piccole molecole secondo un meccanismo di esclusione molecolare. Questo ha un duplice vantaggio: da un lato protegge l’enzima da batteri e altri composti che potrebbero assorbirsi; dall’altro impedisce all’enzima di fuoriuscire verso la soluzione, specialmente nel caso di immobilizzazioni fisiche.

nuovi biosensori applicabili nei settori agroalimentare (acido lattico, caffeina in collaborazione con Illycaffè), ambientale (sostanze genotossiche e pesticidi), chimico- clinico (glucosio, colesterolo e urea). biosensore dedicato all’analisi di alcuni elementi chiave nella fermentazione alcoolica. Si tratta di un dispositivo in grado di determinare con facilità e precisione, direttamente dalle botti o dai grappoli di uva e senza ricorrere ad analisti esperti, i livelli di etanolo, glucosio e fruttosio presenti nel vino, nel mosto o negli acini (glucosio e fruttosio), consentendo di conoscere rapidamente il momento migliore per cominciare la vendemmia e il grado di fermentazione raggiunta nel processo di vinificazione.