Trasformazione degli Organismi vegetali

Trasformazione di Organismi Vegetali Nonostante una diffusa ostilità di larghi strati dell’opinione pubblica riguardo alle piante transgeniche, è certo che queste piante si stanno diffondendo rapidamente: negli USA le coltivazioni di mais transgenico stanno per soppiantare quelle di mais tradizionale. Ad oggi sono trasformate con successo piu' di 120 specie vegetali e numerose piante transgeniche, o loro derivati, sono oggi regolarmente commercializzate.  La prima cellula vegetale resistente agli antibiotici è stata prodotta dalla Monsanto nel La prima pianta trasgenica è stata invece prodotta nell’università belga di Gent nel 1983 Dal primo trasferimento di geni eterologhi in piante di tabacco, descritto indipendentemente da tre gruppi nei primi anni ‘80, i metodi di trasformazione di cellule vegetali si sono perfezionati e sono diventati affidabili.

*La trasformazione mediata da Agrobacterium (metodo indiretto) *La trasformazione diretta con DNA (tecniche biolistiche, elettroporazione, permeabilizzazione di protoplasti mediata da PEG) In teoria la trasformazione vegetale offre l'opportunita' di introdurre geni di qualunque origine nelle cellule vegetali (geni omologhi/eterologhi). Queste cellule vengono, quindi, rigenerate producendo piante transgeniche che contengono ed esprimono la nuova informazione genetica. La maggior parte delle piante transgeniche viene generata usando due metodi generali che sono:

La totipotenza delle cellule vegetali e le tecniche di propagazione in vitro A differenza delle cellule animali che possono rigenerare altri organismi SOLO a partire da cellule della linea germinale, nelle piante qualunque tessuto può rigenerare una pianta intera Lo stadio differenziativo dei tessuti vegetali è reversibile e può essere manipolato in vitro variando il rapporto di auxina e citochinina, due ormoni vegetali che regolano proliferazione e differenziamento Con tecniche di micropropagazione in vitro, utilizzando degli espianti, si puo’ indurre la perdita del programma differenziativo. i calli sono colture di tessuti indifferenziati, che possono essere mantenute per lungo tempo in coltura, da cui possono essere rigenerate piante intere e fertili variando il rapporto aux/ck. Un alto rapporto aux/ck induce differenziamento radicale, mentre un basso rapporto aux/ck induce differenziamento vegetativo.

Due metodi per coltivare in vitro tessuti vegetali indifferenziati: la coltura di calli e la coltura di protoplasti Formazione di callo Sub-coltivazione del callo Induzione di germogli su terreno a basso rapporto auxina/citochinina Induzione di radici su terreno ad alto rapporto auxina/citochinina Espianto fogliare su terreno a bassa concentrazione di fitormoni Foglia sterilizzata Coltura di calli

Coltura dei protoplasti su cellule nutrici Coltura di callo Rigenerazione Coltura di cellule in sospensione Centrifugazione e recupero dei protoplasti Coltura di protoplasti Si sterilizza una foglia e si “pela” uno strato di epidermide Si pone lo strato di epidermide su un terreno contenente cellulasi e pectinasi

Agrobacterium  batterio Gram-negativo del suolo in grado di infettare numerose piante dicotiledoni inducendo, in corrispondenza di una lesione, caratteristiche alterazioni tumorali  La virulenza di questi batteri è associata alla presenza di grossi plasmidi, cioè molecole di DNA autonome ed indipendenti dal resto del genoma  un frammento di DNA batterico (T-DNA) viene trasferito dal batterio alla cellula vegetale e si integra STABILMENTE nel genoma della pianta, inducendo nelle piante infettate le caratteristiche modificazioni morfologiche e differenziative. I metodi indiretti

Infezione di Agrobacterium e insorgenza della sindrome tumorale

Il meccanismo del trasferimento del T-DNA Il contatto cellulare è mediato dalla interazione di proteine batteriche di adesione superficiale con specifici recettori della cellula vegetale. Le proteine di Agrobacterium implicate nell'ancoraggio alla cellula vegetale sono codificate dai geni chv, mentre i recettori vegetali sono proteine vitronectina-like.

I geni vir portano alla produzione di una copia a singolo filamento del T- DNA, T-strand, complementare al filamento codificante del T-DNA. Il T- strand a singolo filamento viene exciso, ed il T-DNA, dsDNA, è ricostituito ad opera del sistema di riparo della cellula batterica. Il T-strand ssDNA viene ricoperto da ss-binding proteins che lo proteggono dall'attacco di proteasi e gli conferiscono una forma bastoncellare che ne facilita l'ingresso nella cellula vegetale utilizzando un pilus formato dall'assemblagio di proteine codificate dal batterio. La traslocazione del complesso T-strand-proteine al nucleo sembra essere mediato sia da VirD2 che da VirE2. Entrambe le proteine batteriche presentano il Nuclear Localization Signals (NLS). Dopo aver raggiunto la membrana nucleare vegetale il complesso T-strand-proteine entra nel nucleo e il T-strand si integra casualmente e stabilmente nel genoma vegetale. L'intero processo di attraversamento del canale richiede energia fornita da attivita' ATPasica batterica.

VirE2 Segnali polifenolici nella pianta VirA VirG Recettori veetali vitronectina-like VirB

La sindrome crown gall Il T-DNA integrato nelle cellule vegetali presenta tre classi di geni: geni che codificano per l’ormone vegetale auxina il gene che codifica per l’ormone vegetale citochinina geni che sintetizzano degli zuccheri coniugati ad aminoacidi detti opine I fitormoni aux e ck sono sintetizzati utilizzando vie metaboliche di origine batterica. Queste attività enzimatiche permettono la proliferazione delle cellule vegetali trasformate. Le cellule trasformate sintetizzano anche le opine, che gli Agrobatteri utilizzano come fonte di energia, e queste tre classi di geni costituiscono un sistema che favorisce selettivamente la crescita di A.tumefaciens.

Mappa del plasmide Ti di Agrobacterium tumefaciens Regione vir LB RB Traferimento coniugativo Plasmide Ti Catabolismo opine T-DNA

I plasmidi Ti non sono adatti ad essere usati come vettori di trasferimento, perché: sono troppo grandi non hanno siti di restrizione adatti per i clonaggi molecolari inducono tumori vegetali non rigenerabili come piante fertili. L’analisi molecolare dei plasmidi Ti ha dimostrato che, mentre RB e LB sono essenziali per il trasferimento del T-DNA, paradossalmente il T- DNA stesso non lo è. Dai plasmidi Ti vengono derivati vettori di trasferimento in cellule vegetali E’ stato dimostrato sperimentalmente che qualunque sequenza di DNA inclusa tra le border repeats (LB e RB) viene trasferita nelle cellule vegetali dall’apparato di trasferimento di Agrobacterium