- Non rappresenta un ostacolo assoluto al passaggio degli xenobiotici nel sistema nervoso centrale, ma fattori anatomici e fisiologici ne riducono la permeabilità -Le cellule endoteliali dei capillari cerebrali hanno giunzioni serrate e i pori sono virtualmente assenti -le cellule endoteliali stesse contengono un carrier proteico ATP-dipendente in grado di trasportare alcune sostanze - i capillari del sistema nervoso centrale sono in gran parte avvolti dalle cellule gliali BARRIERA EMATOENCEFALICA

Barriera ematoencefalica Cellule endoteliali dei microcapillari cerebrali 1) Cellule endoteliali dei microcapillari cerebrali 2) Carriers e sistemi di efflusso (es. glicoproteina-P) che regolano e limitano rispettivamente il transito di particolari farmaci o macromolecole attraverso la barriera emato-encefalica La permeabilità SELETTIVA della barriera emato-encefalica è dovuta:

Glicoproteina P (MDR1) e barriera emato/encefalica La barriera emato/encefalica è un ’ importante interfaccia tra il sangue ed il cervello, è costituita da cellule endoteliali di rivestimento dei capillari, che protegge il cervello dagli xenobiotici e regola l ’ omeostasi cerebrale. Come accade per l ’ assorbimento dei farmaci attraverso il lume intestinale, le caratteristiche fisico/chimiche del farmaco, come ad esempio la lipofilia, determinano il grado del passaggio passivo del farmaco attraverso la barriera emato/encefalica. La glicoproteina P, è una pompa ad efflusso e svolge un ruolo importante nel passaggio dei farmaci attraverso la barriera (ad es. la fenitoina) Il passaggio è regolato dalla presenza di trasportatori, e di pompe come la glicoproteina-P (PGP), nelle membrane luminali delle cellule del rivestimento endoteliale dei capillari cerebrali, che limitano l ’ accesso dei farmaci nel SNC. Il limitato passaggio attraverso la barriera emato/encefalica può rappresentare però anche un ostacolo per un ’ adeguata terapia farmacologica.

La proteina chiamata pompa da efflusso MDR1 o ABC-B1 è una glicoproteina di membrana [glicoproteina-P (PGP)] di 170 Kda. Appartiene alla superfamiglia dei trasportatori di membrana ABC (ATP- Binding Cassette) e funziona da pompa di efflusso transmembranico per i suoi substrati. Ha 6 domini transmembrana e siti di legame per l’ATP. fenitoina pompa MDR1 Canale del sodio Barriera EMATO-ENCEFALICA Questa proteina fisiologicamente ha un'espressione strategica sulle superfici luminali di organi deputati all'assorbimento, distribuzione ed eliminazione dei farmaci. La “ pompa ad efflusso ” o glicoproteina-P, MDR-1 o ABC-B1 È presente nella membrana canalicolare degli epatociti, le membrane ad orletto a spazzola degli enterociti dell'intestino tenue e delle cellule dei tubuli renali prossimali, le cellule endoteliali e gli astrociti della barriera ematoencefalica, la barriera ematotesticolare, il lato materno della placenta e le ghiandole surrenali.

La sua funzione principale è quella di proteggere i tessuti normali dalle tossine esogene o endogene, impedendone l'assorbimento intestinale e l'accesso ai “santuari” e favorendone l'eliminazione sistemica La glicoproteina P è ritenuta essere uno dei più importanti trasportatori di tipo ABC che regolano la distribuzione di farmaci relativamente idrofobici e anfipatici nel corpo umano. La PGP esplica la sua funzione attraverso 3 vie: 1. Limitazione dell’assorbimento del farmaco: trasferimento del farmaco dagli enterociti al lume intestinale ed eliminazione del farmaco con le feci. FUNZIONI della pompa MDR1 o P-GP La PGP è stata identificata inizialmente in cellule tumorali, la cui resistenza agli agenti antitumorali era dovuta ad una sua iper espressione -> (Multi Drug Resistence Protein). Potrebbe funzionare rimuovendo la “il farmaco” dalle cellule che risulteranno quindi resistenti. In seguito si è riscontrata la sua presenza in tessuti normali. 2. Eliminazione attiva del farmaco: a) trasferimento del farmaco dalle cellule del tubulo prossimale al lume tubulare ed eliminazione del farmaco con le urine; b) trasferimento del farmaco dagli epatociti alla bile. 3.Limitazione della distribuzione del farmaco ai tessuti

Substrati della glicoproteina-P codificata dal gene MDR-1 ANTITUMORALI  -BLOCCANTIINIBITORI DELLA PROTEASI HIV Actinomicina DDiltiazemIndinavir DaunorubicinaNicardipinaRitonavir DoxorubicinaVerapamilSaquinavir Etapaside CARDIACIMORFINE Mitomicina DCARDIACIMORFINE Paclitaxel (taxol)Propafenonemorfina-6-glucoronide TamoxifenAmiodaroneMorfina TopotectanQuinidinaLoperamide VinblastinaDigossina ATTIVI sul SNCPEPTIDI Gramicidina ANTIALLERGICI ANTIALLERGICIDomperidonevalinomicina TerfenadinaFlufenazinaN-Acetil-leucil-leucil- norleucina Ondansetron STEROIDI ANTIBIOTICIPerfenazinaSTEROIDI CefazolinFenoxazinaAldosterone CefoperazoneFenitoinaDexametasone Dexametasone IdrocortisoneIMMUNOSOPPRESSORI Ciclosporina A Tacrolimus

Inibitori della Inibitori della trascrittasi inversa Inibitori trascrittasi inversa non-nucleosidica (NNRTis) della proteasi (Pis) nucleosidica(NRTis) nucleosidica (NRTis) Zidovudina (ZDV) Nevirapina (NVP) Saquinavir (SQV) Didanosina (ddl) Efavirenz (EFV) Ritonavir (RTV) Stavudina (d4T) Delaviridina (DLV) Indinavir (IDV) Zalcitabina (ddC) Nelfinavir (NFV) Lamivudina (3TC) Amprenavir (APV) Abacavir (ABC) Lopinavir e ritonavir Farmaci antiretrovirali (substrati della pompa MDR-1)

Tipo di tossicità Manifestazioni cliniche Tossicità mitocondriale Miopatia Miocardiopatia dilatativa Neuropatia periferica Epatotossicità Pancreatite Teratogenicità Ipersensibilità Sindrome da ipersensibilità “Rash” della pelle Epatite Polmonite Nefrite Lipodistrofia Accumulo di grasso Atrofia del tessuto adiposo Ipertrigliceridemia Resistenza all’insulina Aterosclerosi Osteopenia Miscellanea Eventi avversi gastro-intestinali Manifestazioni psichiatriche Nefrolitiasi Emorragie Interazioni Eventi avversi associati a farmaci retrovirali

Il gene MDR-1 Il gene ABC-B1 [MDR 1 (Multidrug Resistance 1)] è localizzato nell’uomo sul cromosoma 7 in posizione 7q21 7q21 MDR1 Regioni tradotte Regioni non tradotte 5’5’ 3’3’ La regione genomica coperta dal gene è molto grande (circa bp) Il gene è costituito da 28 esoni Il mRNA è di 4646 basi La proteina è di 1280 ammino acidi

Disegno schematico della glicoproteina P (MDR1) La proteina ha 6 domini transmembrana e lega ATP N 21 D N 183 S N 400 SR 492 C A 893 S S 1141 T ATP- binding domain

Un primo screening sistematico per SNPs nel gene MDR1 è stato condotto da Hoffmeyer nel 2000 In questo lavoro hanno analizzato mediante amplificazioni e sequenziamento i 28 esoni, la regione promotrice e le giunzioni esone- introne in individui di razza caucasica, sani Sono stati identificati 21 diversi SNPs, alcuni dei quali in regioni importanti della proteina, altri in regioni silenti Ricerca di polimorfismi nel gene MDR1

Hoffmeyer, S. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, Strategia di Hoffmeyer per identificare polimorfismi nel gene dell ’ MDR-1

SNPs identificati nel gene MDR1 nella popolazione caucasica

# localizzazione posizione allele effetti frequenza allelica genotipo frequenza genotipo Variante nella posizione 893

La sostituzione silente in posizione 3435 C-> T è stata trovata associata con variazione dei livelli delle glicoproteina P nell ’ intestino, nella popolazione caucasica Gli individui che hanno entrambi gli alleli con CC hanno una quantità di proteina circa doppia nell ’ intestino tenue rispetto ai soggetti con entrambi gli alleli TT (P=0,056) I soggetti eterozigoti hanno un ’ espressione intermedia della proteina Effetti di una sostituzione silente sui livelli di glicoproteina P

Polimorfismi genetici per i geni codificanti per i BERSAGLI PRIMARI dell’azione dei farmaci Recettori, canali ionici, enzimi, pompe, trasportatori Questo tipo di polimorfismo ha un forte impatto sulla risposta individuale al trattamento farmacologico. Influenzando l’efficacia del trattamento

Aspetti nella FARMACODINAMICA dei farmaci responsabili della risposta variabile in diversi individui I farmaci devono legare i loro “target” come recettori o enzimi per modulare il loro comportamento, così geni che codificano proteine coinvolte in questi processi devono necessariamente essere coinvolti nella risposta ai farmaci.

I recettori adrenergici sono complessi proteici disposti lungo la membrana cellulare. I recettori di questo tipo sono generalmente monomerici e sono costituiti da tre parti: la parte extracellulare (per la glicosilazione) la parte transmembrana (forma una tasca) la parte intracitoplasmatica, dove avviene il legame G- proteico I recettori possono essere stimolati da ormoni (es. dai neurotrasmettitori come la adrenalina o la noradrenalina ed altri) o da farmaci Recettori adrenergici

I recettori adrenergici I recettori adrenergici si possono classificare in recettori di tipo       e     I recettori   hanno  pressochè la stessa AFFINITA’ per la noradrenalina e l’adrenalina. I recettori   hanno affinità maggiore per l’adrenalina che per la noradrenalina. Dopo il sequenziamento del genoma si sono identificate altre forme di recettori sia  che  3 geni diversi per il recettori di tipo  1 (1A,1B,1C); 3 per  2 (2A,2B,2C,); ed un altro recettore di tipo  chiamato  3 I recettori, sia di tipo  che  sono accoppiati, attraverso le Proteine G, alle proteine effettrici, che devono rispondere al segnale che deriva dal legame con il recettore. Nel fegato ad esempio, l’attivazione dei recettori  e  aumenta la sintesi di AMPc (secondo messaggero), il che porta ad una cascata di eventi culminante nell’attivazione della glicogeno fosforilasi e degradazione del glicogeno per produrre glucosio. Nel cuore, invece, l’attivazione dei recettori  aumenta l’ingresso di calcio attraverso la membrana cellulare ed il suo sequestro all’interno della cellula con conseguente aumento della frequenza cardiaca

Membrana cellulare Ligando Numerose proteine in questa via possono causare una risposta del tessuto fosfodiesterasi Proteina chinasi A Eventi successivi alla stimolazione del recettore L’attivazione del recettore promuove la dissociazione del GDP dalla subunità  della proteina G interessata (che può avere effetti sia stimolatori che inibitori). Anche i “canali ionici” sono proteine effettrici di questa cascata

Organo o tessutoAdrenorecettori predominanti Effetti di attivazioneEffetti fisiologici CUORE  Contrazione muscolareIncremento di frequenza cardiaca MUSCOLO LISCIO BRONCHIALE  Contrazione del muscolo liscio Chiusura delle vie aeree  Rilassamento del muscolo liscio Dilatazione e apertura delle vie aeree MUSCOLO LISCIO DELLE ARTERIOLE  Contrazione del muscolo liscio Costrizione delle arteriole e incremento della pressione sanguigna (IPERTENSIONE)  Rilassamento del muscolo liscio Dilatazione delle arteriole e incremento del sangue che arriva ai muscoli VENE  Costrizione delle arteriole e incremento della pressione sanguigna (IPERTENSIONE)  Rilassamento del muscolo liscio Dilatazione delle vene e decremento della pressione sanguigna (IPOTENSIONE) FEGATO  Attivazione degli enzimi che metabolizzano il glicogeno e inattivazione degli enzimi che lo sintetizzano Degradazione del glicogeno per produrre glucosio MUSCOLO LISCIO DEL TRATTO G. I.  RilassamentoArresto temporaneo della digestione RENE  Incremento della secrezione di renina Incremento della pressione sanguigna TESSUTO ADIPOSO  Attivazione delle lipasiDegradazione del grasso Elenco dei recettori adrenergici

I recettori  adrenergici sono recettori accoppiati a proteine G ed hanno un importante ruolo nelle funzioni cardiovascolari. I recettori  adrenergici (ADR  ) Sono recettori di neurormoni (ad es. noradrenalina). Nei reni stimolano il rilascio di renina, quindi giocano un ruolo nell’ attivazione del sistema renina -> angiotensina -> aldosterone. Questi recettori sono localizzati anche nelle arterie, e la loro stimolazione determina vasodilatazione. L’ importanza dei recettori  è anche derivata dall’importante ruolo dei farmaci le cui azioni si basano sul loro legame a questo recettore. Ad esempio i  -agonisti come albuterolo, debutamina, dopamina e isoproterenolo. Importanti sono anche i  bloccanti che sono utilizzati su larga scala per infarti cardiaci e ipertensione, per l’angina cronica ed altro.

SNPs non silenti delle regioni codificanti di un recettore a 7 domini transmembrana possono determinare, a seconda della localizzazione della sostituzione nucleotidica e quindi amminoacidica a livello proteico modificazioni nell’attività di agonisti ed antagonisti, ridotto accoppiamento con le proteine G (ridotta capacità di TRASDUZIONE DEL SEGNALE) o anche aumentata internalizzazione da agonisti e quindi ridotta espressione sulla superficie delle cellule Polimorfismi dei recettori adrenergici

ADR  2 Il gene per il recettore  2 adrenergico ADR  2 Il gene mappa sul cromosoma 5 in posizione 5q31-q32 Il gene è privo di introni Il mRNA è di 2005 basi La proteina è di 413 amminoacidi, ed ha 7 domini transmembrana 5’5’ 3’3’ Regioni tradotte Regioni non tradotte

Localizzazione del recettore  2 adrenergico nel bilayer lipidico della membrana REGIONE EXTRACELLULARE REGIONE CITOPLASMATICA

Diverse persone mostrano variazioni nel gene che codifica le informazioni per il recettore adrenergico  2 su cui l’albuterolo agisce. Una singola sostituzione nucleotidica causa il cambio di un amminoacido nella proteina recettore -> l’amminoacido in posizione 16 arginina è sostituito da una glicina (mutazione “di senso”) Questa sostituzione determina la mancanza di risposta all’albuterolo o a farmaci che agiscono in modo simile L’albuterolo è un  2 -agonista che viene usato per controllare i sintomi nel corso di un attacco di asma; agisce interagendo con il recettore   adrenergico - > l’effetto è un rilassamento dei muscoli a livello toracico, che favorisce il respiro I polimorfismi nel gene che codifica il recettore adrenergico  2 possono alterare la risposta ai farmaci

Polimorfismi genetici al locus del recettore adrenergico  2 Oltre alla regione codificante del gene è necessario considerare una piccola regione al 5’ che codifica per un piccolo polipeptide di 19 amminoacidi chiamato 5’ Leader Cistron (5’ LC) Questo piccolo peptide è coinvolto nella regolazione dell’espressione del recettore Finora sono stati riconosciuti 11 polimorfismi nel recettore adrenergico  2, 4 dei quali alterano la sequenza proteica del recettore. Le posizioni dei cambi sono : 16 (Arg -> Gly),27 (Gln -> Glu),34 (Val -> Met) e 164 (Thr -> Ile). 16 (Arg -> Gly) -> effetto sul legame con l’ albuterolo, nessun effetto sull’ attivazione dell’adenilciclasi

Albuterolo Recettore adrenergico  Arg BRONCODILATAZIONE Recettore adrenergico  Un polimorfismo nel recettore ADR  può determinare -> nessuna risposta al farmaco BRONCODILATAZIONE Gly Recettore adrenergico  Gly Recettore adrenergico  Albuterolo Arg

Polimorfismi genetici al locus del recettore adrenergico  2 Oltre alla regione codificante del gene è necessario considerare una piccola regione al 5’ che codifica per un piccolo polipeptide di 19 amminoacidi chiamato 5’ Leader Cistron (5’ LC) Questo piccolo peptide è coinvolto nella regolazione dell’espressione del recettore Finora sono stati riconosciuti 11 polimorfismi nel recettore adrenergico  2, 4 dei quali alterano la sequenza proteica del recettore. Le posizioni dei cambi sono : 16 (Arg -> Gly), 27 (Gln -> Glu), 34 Val -> Met e 164 (Thr -> Ile). Il polimorfismo all’amminoacido 34 (Val 34 -> Met) insorge raramente e non è stato collegato a modificazioni nel funzionamento del recettore. 16 (Arg -> Gly) -> effetto sul legame con il aldobuterolo, nessun effetto sull’ attivazione dell’adenilciclasi La sostituzione all’amminoacido 164 Thr ->Ile mostra una ridotta affinità per l’ isoprotenolo, epinefrina, e norepinefrina; a cui si associa una attività più ridotta dell’adenilciclasi paragonata all’allele normale (Thr 164) 27 (Gln -> Glu) -> nessun effetto né sul legame con il ligando, né nell’attivazione dell’adenilciclasi Gli omozigoti Glu 27 mostrano una aumentata vasodilatazione a seguito dell’uso di farmaci  agonisti. Entrambe queste sostituzioni riguardano il dominio extracellulare

La regione 5’ LC mostra 9 polimorfismi ed uno che determina un cambio al primo amminoacido del piccolo peptide (Cys -19 -> Arg); in aggiunta questo polimorfismo è molto spesso associato al cambio in posizione 27 Gln -> Glu 27. L’ Arg 16 invece è raramente associato a Arg -19 I tre APLOTIPI più comuni sono : Cys -19 (wt)/ Arg 16 (wt) / Gln 27 (wt)(CRQ) Arg -19 (m) / Gly 16 (m) / Glu 27 (m) (RGE) Cys -19 (wt)/ Gly 16 (m) / Gln 27 (wt)(CGQ) mostra una più elevata espressione del recettore paragonata all’allele selvatico Studi in vitro di mutagenesi sito specifica hanno dimostrato che la sostituzione Cys -19 -> Arg mostra una più elevata espressione del recettore paragonata all’allele selvatico Regione 5’ Leader Cistron

Differenze etniche nelle frequenze alleliche del recettore  2 Polimorfismi Afroamericani Caucasici Asiatici 5’ LC Cys -19 -> Arg -19 Arg -19 0,21 0,35 0,08 Arg 16 -> Gly 16 Gly 16 0,49 0,46 0,59 Gln 27 -> Glu 27 Glu 27 0,20 0,35 0,07 Thr 164 ->Ile 164 Ile 164 ND 0,04 ND

Disegno schematico del recettore  2 con le posizioni dei polimorfismi Gln 27 -> Glu 27 Arg 16 -> Gly 16 Thr 164 -> Ile 164 Dominio extracellulare Dominio intracellulare HOOC TMD -> dominio intermembrana IL -> loop intracellulare EL -> loop extracellulare -NH 2 Val 34 -> Met Leader Cistron (Cys -19 -> Arg)

c

11 SNPs nella regione codificante del gene –5 silenti –4 con sostituzione aminoacidica in 16, 27, 34 and 164 aa 9 SNPs nella regione 5’ a monte –1 in una seguenza che codifica per BUP (Beta Upstream Peptide; 19 aa) che regola l’espressione del recettore  -2. Polimorfismi del recettore adrenergico  -2

In vitro assay of polimorphic function Wild-type receptor cDNA Polimorphic receptor cDNA Normal responsePolimorphic response Biological function

Fenotipo in cellule CHO del polimorfismo Ile 164 Si è valutata l’attività dell’adenilciclasi a seguito della stimolazione del recettore con la epinefrina L’attività dell’adenilciclasi a seguito del legame del recettore polimorfico Ile 164 con l’epinefrina è sensibilmente ridotta rispetto all’attività del recettore wild type In vitro : Riduzione nell’attivazione del recettore  -2 sul muscolo liscio bronchiale.

Fenotipi varianti del recettore  2 Questi fenotipi sono stati osservati in cellule o in sistemi transgenici 4616Arg 16 normale 4616Gly 16 nessuna risposta all’albuterolo; + alterata regolazione (maggiore espressione) Nucleotideamminoacido designazione fenotipo 7927Gln 27 normale 7927Glu 27 alterata regolazione ( minore espressione) 10034Val 34 normale 10034Met 34 normale Thr 164 normale Ile 164 alterata regolazione (ridotto accoppiamento ed altro)

La promessa della FARMACOGENETICA è l’ottimizzazione della terapia con i farmaci basata sul PROFILO GENETICO del paziente. La nuova FARMACOGENETICA è focalizzata principalmente sugli SNPs poiché essi rappresentano la più comune classe di varianti genetiche codificate nel genoma umano.

Insieme di polimorfismi (SNPs) a due o più loci strettamente associati su un cromosoma, generalmente ereditati come un’unità. Aplotipo relativo ai polimorfismi

Relazione di profili di SNPs e risposta ai farmaci Situazione predittiva di EFFICACIA Situazione predittiva di non EFFICACIA Profilo SNP Pazienti che non hanno avuto effetti terapeutici efficaci nelle prove cliniche Pazienti che hanno avuto effetti terapeutici efficaci nelle prove cliniche

Ricerca di Base (3-5 anni) Sperimentazione Clinica Trials Clinici (5-7 anni) Sperimentazione Clinica Trials Clinici (5-7 anni) Fasi per lo sviluppo di un farmaco Questa è la fase più costosa, in cui si fa la sperimentazione su esseri umani. Studi in vivo su modelli animali e cellulari (2-4 anni) Sperimentazione preclinica (su piccoli Mammiferi) (2-4 anni

Fasi dei “trials clinici” Procedura attuale Proposta Richiesta di autorizzazione all’immissione in commercio Richiesta di autorizzazione all’immissione in commercio per chi risponde al farmaco senza effetti collaterali comuni volontari Si potrebbero già effettuare valutazioni genetiche preliminari FASE I (studi di tollerabilità) pazienti Su pazienti si potrebbe procedere all’identificazione dei profili SNP di efficacia e di tollerabilità FASE II (valutazione di attività ed efficacia del farmaco) pazienti Numero minore di pazienti e solo quelli che sono stati identificati in FASE II come coloro che rispondono al farmaco FASE III (valutazione allargata di attività ed efficacia del farmaco) Valutazione dei rari effetti avversi dopo l’immissione sul mercato Valutazione dei rari effetti avversi dopo l’immissione sul mercato FASE IV commercializzazione e farmacovigilanza

Il futuro della farmacogenomica Medicina predittiva e terapia personalizzata Il farmaco giusto alla corretta dose, per ogni paziente

Localizzazione cellulare della glicoproteina P La localizzazione di questa proteina nei tessuti è importante per gli effetti del farmaco e per la sua disponibilità nei tessuti TessutoLocalizzazioneFunzione Intestino tenuemembrana apicale delleSecrezione di farmaci e coloncellule epiteliali (lume)nel lume dell ’ intestino Fegatomembrana canalicolaresecrezione di farmaci degli epatocitinella bile Renemembrana apicale dellesecrezione del farmaco cellule epiteliali dei nel lume dei tubuli tubuli prossimali CNSmembrana verso il lumeprotezione del CNS dagli delle cellule endotelialixenobiotici forma la barriera emato/encefalica TesticoliCellule endoteliali dei barriera sangue/testicoli capillari sanguigni Placentatrofoblastiprotezione del feto dagli xenobiotici