Terapia genica e rischio di trasformazione tumorale Problematiche ematologiche nel trapianto di midollo Bioetica geni e terapia Immunità batterica contro i batteriofagi Le immunodeficienze primitive Nuove frontiere del gene editing Altri professori per ciascuna di queste lezioni

Storie di malattie e curiosità varie

Immunodeficienza legata al cromosoma X The thymus and other lymphoid tissues in congenital agammaglobulinemia. I. Thymic alymphoplasia and ymphocytic hypoplasia and their relation to infection. Gitlin D, Craig, JM Pediatrics 32: , 1963 Precoce e grave Difetto timico Oggi X-SCID (B+ T-) Più tardiva e meno grave Oggi XLA o m. di Bruton (B- T+) SCID = severe combined immunodeficiency

Immunological reconstitution of sex- linked lymphopenic immunological deficiency. Gatti RA et al. Lancet 1968;2: Il primo trapianto di midollo osseo con successo in una grave immunodeficienza venne fatto nel 1968 Nelle Immunodeficienze più gravi il trapianto è relativamente facile, perché non c’è un sistema immunitario in competizione nel ricevente. In altri casi è necessario prima rimuovere il sistema non funzionante con pesanti terapie …

1. Prelievo 4. Infusione 5. Homing

David Vetter, n 21 sett 1971 I genitori vengono informati: un altro maschio ha il 50% di rischio di malattia - Aborto se maschio? - Nascita e mantenimento in ambiente sterile fino a disponibilità di una terapia (trapianto da sorella se compatibile) XY X 7m X-SCID David Joseph VetterCarol Ann Vetter Ma la sorella non risulta perfettamente compatibile

Milredhuis: prima clinica per aborto in Olanda (Arnhem) in USA

1968

Più il bambino cresce, meno accetta la propria condizione A 12 anni trapianto dalla sorella Dopo 15 gg muore di linfoma di Burkitt

The use of HLA-nonidentical T-cell-depleted marrow transplants for correction of severe combined immunodeficiency disease. O’Reilly RJ. Immunodef. Rev 1989;1: Preparazione del midollo da trapiantare con deplezione dei linfociti T Ancora non si conoscono le cause MOLECOLARI della malattia

Eriditarietà X-linked recessiva Approccio posizionale: locus Xq13 Approccio del gene candidato: gamma chain Si comincia a identificare nelle immunodeficienze il miglior campo di apllicazione della terapia genica: Blaese RM, Culver KW. Gene therapy for primary immunodeficiency disease. Immun Rev 1992;3:

La diagnostica immuno-funzionale nelle immunodeficienze: Diagnosticare le malattie e capire il funzionamento del sistema immune al tempo stesso

Profondo difetto dei linfociti. Di solito questi bambini muoiono nel primo anno di vita per infezioni opportunistiche o addirittura per immunizzazione con vaccini virali vivi o con BCG.

- X-SCID diagnosticata in soggetto con familiarità - fenotipo attenuato con presenza di linfociti e risposta ai mitogeni - Reattività ad antigeni vaccinali - Espressione normale della gamma chain! - Assenza della mutazione! Ampia varietà recettoriale: Effetto in fasi precoci di sviluppo Reversione della mutazione Selezione della cellula con il gene wild type => possibilità per terapia genica

Motivi che rendono indicabile una terapia genica: - Malattia letale, non del tutto (e non sempre) curata dal trapianto di HSCT (90% sopravvivenza dopo HLA-id, 80% dopo aplo-id) - Necessità nella maggior parte dei casi di proseguire terapia sostitutiva con IG. - Difetto molecolare ben identificato gene che non richiederebbe rilevate modulazione - il difetto blocca la differenziazione di T e NK - esperimenti in vitro e nell’animale mostrano l’applicabilità della trasferimento genetico in HSCT e l’effetto sulla generazione di linfociti T e NK funzionanti

Separazione con Anticorpi monoclonali Reinfusione Sangue periferico HOMING CLONING Transgeni citochine

I virus sono in grado di entrare selettivamente in cellule e di inserire porzioni del proprio genoma all’interno del DNA cromosomico. Molti oncongeni sono rappresentati da sequenze di origine virale. Utilizzare virus per inserire geni per terapia. Diversi tipi di vettori virali: Esempio: il Moloney murine leukemia virus Retrovirus - 2 molecole identiche di RNA singolo - integrasi e trascrittasi inversa RNA (10 kb) incapsidazione retrotrascrittasienvelope

Cellula packaging Plasmide helper integrato: Geni strutturali del retrovirus ma: - Non sequenze di incapsidazione e integrazione Virus deleto in geni strutturali (non competente per replicazione) Virus infettante ma defettivo Possibilità di: - Minimizzare gli eventi di ricombinazione tra i due (eliminare zone di omologia, ad esempio sostituendo gli LTR del plasmide packaging con promotore di CMV; dividere su due plasmidi helper i diversi geni strutturali) - adattare il bersaglio con specifici geni env Ma RISCHI NON VIRLOGICI: Inserzione nel genoma casuale - Possibile mutagenesi inserzionale PRECAUZIONI PER MAGGIOR SICUREZZA (VIROLOGICA)

Cellule staminali CD34+ dal midollo osseo del paziente. - Coltivate in terreno “X-vivo 10” con i seguenti fattori: - fetal-calf serum - stem-cell factor - Flt-3 ligand - interleukin-3 - PEG–conjugated megakaryocyte growth and differentiation factor - Trasduzione con il vettore Le cellule vengono coltivate fino ad un’espansione x5 – x8. Infusione di 14 – 18 milioni / kg di peso di cellule CD34+ senza regime di condizionamento.

Numero Linfociti Percentuale linfociti trasdotti

Nuovi linfociti naive Passaggio timico

In 4/5 pazienti con X-SCID, trattati con terapia genica Evidenza di - ricostituzione di un sistema immune funzionante - beneficio clinico duraturo Protocollo safe: - non evidenza di retrovirus competenti per replicazione Buona selezione delle cellule trasdotte: - evidenza che tutti i T e gli NK presenti sono trasdotti

Due casi di leucemia in pazienti sottoposti a terapia genica per X-SCID.

2 facce della stessa moneta: - Possibilità di inserire stabilmente il gene nel cromosoma e di permetterne un’espressione in quantità sufficiente - Rischio di mutagenesi inserzionale che può risultare in un’attivazione di proto-oncogeni fino a 100 kbp di distanza dal sito di integrazione, favorendo lo sviluppo di malignità.

La conta T continua ad aumentare (50, ,000 per mm3) Improvvisamente aumentano a 300,000 per mcL, Con presenza di blasti nel sangue Infiltrazione del midollo osseo, splenomegalia = T-ALL (leucemia linfoblastica T) Terapia convenzionale seguita da una seconda re-induzione e da un BMT allogenico da donatore Follow-up: remissione clinica completa e sostenuta, ma persistono alcune cellule anormali

Assenza di retrovirus competenti per replicazione. La presenza di virus infettante avrebbe potuto favorire inserzioni (metodica: valutazione di infettività dei sopranatanti … etc.) Valutazione dei siti di integrazione : come faccio a sapere dove si è integrato il trasgene? - FISH ? Può darmi già informazioni importanti se il sito di integrazione è quello di traslocazioni implicate nella trasformazione leucemica. - LAM-PCR = indicazione specifica del sito di integrazione

DNA proviraleDNA genomico Amplificazione (x 100) B B Selezione magnetica Con biglie coniugate ad avidina B A A A B Random priming B Frammento a doppia elica sticky end B Taglio blunt end Taglio sticky end B Taglio Ligazione di un adattatore Doppia elica Nested PCR Linear Amplification Mediated PCR

Il LIM domain Un dominio ricco di zinc finger dedicato a interazioni proteiche Come l’iperespressione di LMO2 facilita la trasformazione tumorale Attraverso queste interazioni vengono assemblati complessi trascrizionali.

LMO2 è coinvolto anche in casi spontanei di T-ALL - break points t(11;14)(p13;q11) o t(7;11)(q35;p13) - è un oncogene abbastanza T-specifico (anche se non è indispensabile per lo sviluppo dei T, ma lo è per gli stadi precoci dell’ematopoiesi) Perché integrazione in LMO2? - Perché i retrovirus si integrano più facilmente in geni attivi (come LMO2 in fase di ematopoiesi precoce) Perché mutagenesi inserzionale solo nei T? - Perché sono sottoposti a pressione selettiva nella X-SCID

- circa 30,000 geni nel genoma umano, - I retrovirus si integrano preferiilmente nei geni espressi - LMO2 è espresso nelle cellule CD34+ - nel trial sono state trasdotte 90 milioni di CD34 E’ probabile che la popolazione reinfusa contenesse progenitori cellulari con inserzione retrovirale all’interno di LMO2 (la laucemia si è verificata nei soggetti trattati con maggiori dosi del vettore)

TCR