Colture di cellule e di tessuti animali Gli esperimenti biologici si possono condurre sia su organismi interi che su organi e tessuti animali isolati. Lavorando su tessuti e organi gli esperimenti in genere sono a breve termine, poichè è necessario mantenere il tessuto il più possibile in uno stato simile a quello fisiologico.

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Cos’è una Cellula Staminale E’ una cellula non specializzata capace di dividersi e di dare origine a cellule dei diversi tessuti adulti. Le distinguiamo in: EMBRIONALI, sono totipotenti, possono dare origine a qualsiasi tipo di cellula; FETALI, sono pluripotenti, possono dare origine solo ad alcuni tipi di cellule; PLACENTARI, sono pluripotenti, prelevate dal sangue del cordone ombelicale o dalla placenta; ADULTE, sono pluripotenti ed ematopoietiche.

L'applicazione più importante delle cellule staminali per il futuro risiede nel campo della Medicina Rigenerativa. Con questa branca s'intende la produzione di una grande quantità di cellule da utilizzare nelle terapie che permettono la ricostruzione dei tessuti danneggiati nei malati di Parkinson e nell'Alzheimer, nelle ustioni, nell'infarto, nel diabete, nelle osteoartriti e nelle artriti reumatoidi o nei danni alla colonna vertebrale. L’importanza delle cellule staminali

Early Moments in Mammalian Development Zygote MorulaBlastocyst

Day 5 Human Embryo Blastocyst Stage, ~ 100 cells Trophoectoderm (placenta and amnion) Inner cell mass (all tissues in the body) 1/100 inch

Human Embryonic Stem Cells

Ectoderm Outer surface Skin CNS Neuron Neural Crest Melanocyte MesodermEndoderm Dorsal Notochord Paraxial Bone tissue Intermediate Tubule cell of the kidney Lateral Red Blood Cell Blood vessels Heart Head Facial Muscle Digestive Tube Pancreatic Cell Pharynx Thyriod Cell Respiratory Tube Alveolar Cell Germ Cells Sperm and Egg The inner cell mass gives rise to all the cells in the body.

During development, the daughters of the inner cell mass differentiate into the cell types of the body. Time of Gestation After Birth Endoderm Mesoderm Ectoderm Germ Sperm Or Eggs Skin Brain Hear t Blood Gut Inner Cell Mass

The embryonic stem cell is the stem cell of stem cells Endoderm Mesoderm Ectoderm Germ Sperm Or Eggs Skin Brain Hear t Blood Gut Scientists have figured out how to make inner cell mass cells self- renew in plastic dishes. A few hundred cells from one embryo can be grown into at least 1.3 × cells creating a stem cell line. Embryonic Stem Cell

Staminali embrionali: PRO Sono tutte totipotenti Presentano una grande capacità di proliferazione Possono mantenersi più a lungo in coltura Maggior facilità di prelievo CONTRO Presentano un’alta probabilità di rigetto non hanno ancora raggiunto risultati clinici concreti Non è ancora possibile controllare né l’espressione genica, che ne determina la differenziazione, né l’espansione (per ora se impiantate si sviluppano come tumori)

Utilizzo e problemi relativi alle Staminali Embrionali DIFFERENZIAMENTO: deve essere indotto e la cellula deve raggiungere la regione lesionata; RIGETTO: le SE possiedono un corredo cromosomico eterologo; CANCEROGENICITA’: le cellule del nodo embrionale della blastocisti sono capaci di dividersi infinitamente come quelle cancerose.

Cellule staminali sanguigne Da midollo osseo degli adulti Queste cellule producono normalmente tutti i tipi di cellule ematopoietiche (globuli rossi, globuli bianchi, piastrine). Fino a poco tempo fa, gli scienziati pensavano che fosse impossibile che le cellule staminali ematopoietiche potessero tornare multipotenti, potendo quindi reinventarsi per dare origine a tipi di cellule completamente differenti come quelle cerebrali, nervose, intestinali o epiteliali. Esperimenti realizzati in diversi centri di ricerca dimostrano che questo è possibile. Dal cordone ombelicale, il cui sangue è ricco di cellule staminali. Le cellule staminali così raccolte potranno essere utilizzate per curare malattie sanguigne. In futuro, il sangue del cordone ombelicale potrebbe rappresentare una fonte di cellule staminali importantissima per curare le lesioni vascolari o cerebrali, il diabete, il morbo di Parkinson e la distrofia muscolare. La particolarità della raccolta di queste cellule è quella di poterle prelevare senza toccare né la madre né il bambino. Sono inoltre compatibili con il neonato nel caso in cui sviluppi una certa malattia o abbia bisogno di cellule staminali. Le cellule staminali adulte sono reperibili anche in altre zone dell’organismo umano adulto: si possono trovare in zone specifiche del sistema nervoso, in alcuni tessuti muscolari, nei tessuti adiposi, epiteliali, connettivi…. Da feti abortiti in modo spontaneo I feti,spontaneamente abortiti, racchiudono una riserva enorme di cellule staminali già differenziate (Committed) ma nello stesso tempo ad alta potenzialità genica e altamente prolifiche Staminali adulte

Our bodies have many adult stem cell niches Blood Gut Skin Bone, Skin, Tendon, cartilage Liver

Staminali adulte: PRO Non presentano rigetto In alcuni casi si trovano già nel tessuto da curare Il loro utilizzo non lede, non sopprime e non danneggia nessun altro essere umano in qualunque stadio del suo sviluppo Sono già stati ottenuti importanti risultati clinici CONTRO Sono difficili da coltivare e da isolare Presentano una proliferazione più lenta di quelle embrionali

Problemi relativi alle Cellule Staminali Adulte o da Cordone Ombelicale Hanno limitata potenzialità a dare diversi tipi cellulari; Sono presenti in un numero inferiore; Quelle da cordone ombelicale sono più numerose di quelle adulte.

Some research suggests Adult stem cells can be coaxed into changing fate in culture Can I be coaxed Into making neurons Or cardiac muscle?

K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) reported Reprogramming of mouse somatic cells with defined factors- The iPS cells can be generated by the addition of several combinations of transcription factors (Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc).The standard mixture contains Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc, and that mixture can induce reprogramming in mouse, human, rat, pig, and dog. Mouse iPS cells can differentiate into all three germ cell layers and contribute to chimeric mice after they are injected into blastocysts which indicate their pluripotency. iPS cells have a unlimited proliferation in vitro, while maintaining their pluripotency. These characteristics could allow the iPS cells to supply patient-specific pluripotent stem cells. Induction of pluripotency by defined factors iPS esprimenti GFP

The original method of iPS induction used a retrovirus vector for transgene expression. This vector can robustly infect a variety of cell types and introduce their coding genes into the host genome by reverse transcriptase which thereby enables constant transgene expression during reprogramming. The expression of retroviral transgenes continues until the cells become iPS cells. However, the retrovirally derived iPS cells have numerous transgene integrations in the genome, and the integrations may result in leaky expression which could disturb endogenous transcription factor network and lead to failure of differentiation. Another important problem of transgene integration is tumorigenic risk after transplantation. In particular, c-Myc, one of the reprogramming factors, is a well- known oncogene, and its reactivation could give rise to transgene derived-tumor formation in chimeric mice

Removal of the c-Myc transgene from reprogramming cocktail is one important approach to make IPS. Human and mouse iPS cells can be established from fibroblasts with only Oct3/ 4, Sox2, and Klf4, although the efficiency is significantly reduced However, the overexpression of Oct3/4 and Klf4 can cause tumor formation, and various human tumors express OCT3/4, SOX2 and KLF4. In addition, the retroviral insertion to the genome itself may disturb endogenous gene structure and increase the risk of tumors. Other approach is the reduction of integration sites by viral vectors (adenovirus and Sendai virus), DNA vectors (plasmid, episomal plasmid, and minicircle vector), and direct protein delivery. Their efficiencies of iPS cell induction are lower than that with retrovirus vectors, possibly due to low transduction efficiency, and unstable expression.

Yu et al. reported human iPS induction with a different set of reprogramming factors, including Oct3/4, Sox2, Nanog, and LIN28. Inclusion of Oct3/4 and Sox2 in both sets indicates their importance for reprogramming. The reprogramming efficiency is enhanced by the addition of extra factors, such as ESRRB, UTF1, Sall4, Tbx3, miRNAs (miR-291-3p, miR-294 and miR-295), and shRNAs for p53 or p21. Hanna et al. found some reprogramming factors, such as Lin28 and shRNA for p53, mainly regulate the reprogramming efficiency through the control of cell proliferation. In contrast, Nanog is seemed to enhance the efficiency of reprogramming through affecting the process itself. Oct3/4, Sox2, and Nanog induce the expression of stemness genes, such as STAT3 and ZIC3. These factors are thought to have the opposite function, to repress differentiation related genes.

The alteration of epigenetic modifications is also important for iPS cell induction. iPS cells have epigenetic modification similar to those of ES cells in terms of DNA methylation and histone modifications. The promoter regions of Oct3/4 and Nanog in fibroblasts are highly DNA methylated and inactive, while these regions are demethylated and active in iPS cells. Doi et al. found 71 differential methylation regions (DMRs) between ES cells and iPS cells [31]. The DMRs showed significant accumulation in genes associated with developmental processes that were hypermethylated in iPS cells in comparison to ES cells, which could lead to differentiation failure of iPS cells

Summary Methods for the generation of iPS cells remain at a developmental stage. A reliable method to evaluate the iPS cells must be established. Although many problems still remained to be resolved, iPS cells may be applicable for medical treatment in the future. Studies of disease pathogenesis and drug discovery have already been launched, and thresults thereof could provide important relief to countless people throughout the world.

iPS cells generation in patient fibroblasts Parkinson’s disease (Wernig and Jaenisch, 2008, Maehr and Melton PNAS 2009). Amyopathic Lateral Sclerosis, (Dimos and Eggan Science 2008) Type I diabetes (Maehr and Melton PNAS 2009) Duchenne dystrophin, Parkinson’s disease, Huntington disease, Down syndrome,. (Park and Daley Cell 2008). iPS cells generation from other cell types Blood cells (Loh and Daley 2009). B-cells (Hanna and Jaenisch Cell 2008) Blood stem cells (Emiinli and Hochedlinger Nat Genet 2009) Pancreatic  -cells (Stadtfeld and Hochedlinger Cell Stem Cell2008) Hepatic and gastric endoderm (Aoi and Yamanaka Science 2008) Neural stem cells (Kim and Scholar, Nature 2008)