La batteriorodopsina: una pompa protonica

Halobacterium sp. ceppo NRC-1 5 mm

La Storia della batteriorodopsina 1975: Studi pioneristici di Unwin & Henderson. Cristalli bidimensionali con struttura ricostruita a 7 Å di risoluzione mediante microscopia elettronica. Grande impatto sugli esperimenti successivi e le teorie per la predizione delle eliche transmembrana. 1980: Michel cristallizza la proteina : Struttura EM a ~3 Å di risoluzione, si osserva il retinale legato. 1998: Struttura ai raggi X a 2 Å di risoluzione, e successivamente si ottengono molte strutture in stati meccanicistici differenti 2000: Si comprende il meccanismo della traslocazione protonica in grande dettaglio (grazie alla spettroscopia FT-IR e alla mutagenesi sito-specifica)

Premio Nobel per la chimica (1988) Hartmut Michel primo a cristallizzare la Br nel 1980

Le proprieta’ della batteriorodopsina Catena polipeptidica unica di 248 amminoacidi (determinata dal sequenziamento sia della proteina che del DNA) La proteina è sintetizzata nella cellula nella forma di un precursore con una sequenza N-terminale segnale di 13 amminoacidi e di un residuo di Asp C-terminale che vengono rimossi. La proteina matura pesa 26 kD. L’analisi di sequenza mostra la presenza di 7 a-eliche. Il C-terminale è rivolto verso il citoplasma mentre l’N-terminale è esposto allo spazio extracellulare. Il gruppo prostetico è costituito dal trans-retinale legato alla K216 mediante una base di Schiff.

La struttura primaria e la topologia Khorana, JBC, 1988, 263, 7439

Kyte J, Doolittle RF (May 1982). "A simple method for displaying the hydropathic character of a protein". J. Mol. Biol. 157 (1): 105–32.

Le scale di idropatia scala Kyte & Doolittle costante di ripartizione Arg -4.5 Asn -3.5 Asp -3.5 Cys 2.5 Gln -3.5 Glu -3.5 Gly -0.4 His -3.2 Ile 4.5 Leu 3.8 Lys -3.9 Met 1.9 Phe 2.8 Pro -1.6 Ser -0.8 Thr -0.7 Trp -0.9 Tyr -1.3 Val 4.2 costante di ripartizione L’energia libera per il trasferimento dell’amminoacido dall’acqua al benzene è una misura della idrofobicità benzene H2O

Gli algoritmi moderni permettono di stimare la topologia della proteina (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) TGRPEWIWLALGTALMGLGTLYFLVKGMGVSDPDAKKFYAITTLVPAIAFTMYLSMLL GYGLTMVPFGGEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLNLALLVDADQGTILALVGADGIMIG TGLVGALTKVYSYRFVWWAISTAAMLYILYVLFFGFSMRPEVASTFKVLRNVTVVLWS AYPVVWLIGSEGAGIVPLNIETLLFMVLDVSAKVGFGLILLRSRAIFG out /in membrana topologia=o6-25i38-60o75-97i104-126o130-152i164-183o193-215i

I cristalli bidimensionali

Analisi della struttura I monomeri della batteriorodopsina formano trimeri molto stabili come suggerito dalle immagini al ME. I contatti intermolecolari elica-elica corrispondono a circa 16000 Å2 (circa il 27% della superficie del monomero). E’ presente un ponte salino intermolecolare fra K40 e D104

Le 7 a-eliche ottenute per microscopia elettronica

I cristalli

Strutture della batteriorodopsina pubblicate 1975 microscopia elettronica (Henderson & Unwin, Nature) 7 Å 1990 microscopia elettronica (Henderson et al. J. Mol. Biol.) 3.5 Å 1996 microscopia elettronica (Grigorieff et al.J. Mol. Biol.) 3.5 Å 1997 microscopia elettronica (Kimura et al. Nature) 3.0 Å 1997 diffrazione raggi X (Pebay-Peyroula et al. Science) 2.5 Å 1998 diffrazione raggi X (Luecke et al. Science) 2.3 Å 1998 diffrazione raggi X (Essen et al. PNAS) 2.9 Å 1998 diffrazione raggi X (Takeda et al. J. Mol. Biol.) 3.5 Å 1999 microscopia elettronica (Mitsuoka et al. J. Mol. Biol.) 3.0 Å 1999 diffrazione raggi X (Belrhali et al. Structure) 1.9 Å 1999 diffrazione raggi X (Luecke et al. J. Mol. Biol.) 1.55 Å le strutture sono simili nelle a eliche differenze nelle anse interelica molecole d’acqua e lipidi visibili alle risoluzioni più grandi

Banca dati delle proteine di membrana http://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html#tableDescription

La struttura ad alta risoluzione C-ter il retinale è inserito in una tasca costituita dalle eliche B-G F G B D C G F A E ~ 40Å A E B C D N-ter ~ 30Å spazio extracellulare

La Br è estremamente idrofobica lato citosolico membrana lato extracellulare pdb:1c3w

Analisi della struttura elica B elica C Le anse interelica hanno struttura irregolare. La connessione fra le eliche B e C forma un un foglietto b a 2 filamenti antiparalleli stabilizzato da 6 legami idrogeno

Analisi della struttura Vi è una rete estesa di legami idrogeno interelica (31) che stabilizzano la struttura terziaria del monomero che non risulta essere influenzato dall’arrangiamento trimerico nella membrana Il retinale è posto in una tasca delimitata da molti residui: W86, T89, L93, T90, M118, W138, S141, T142, M145, W182, Y185, W189, D212 E’ presente una rete estesa di legami idrogeno vicino alla base di Schiff fra residui amminoacidici e 7 molecole di acqua, di importanza meccanicistica

Vi è una rete estesa di legami idrogeno interelica (31) che stabilizzano la struttura terziaria del monomero K30-L224 T170-S226 A G F G Y185-D212

Il retinale è posto in una tasca delimitata da molti residui: W86, T89, L93, T90, M118, W138, S141, T142, M145, W182, Y185, W189, D212

(a) Region of the active site that contains an all trans retinal (a) Region of the active site that contains an all trans retinal. The plane of Trp86 and Trp182 flank the polyene chain between the 9-methyl and 13-methyl groups, and contribute to its immobilization in the retinal-binding pocket. Part of the hydrogen-bonded chain that leads from the Schiff base to the extracellular surface via water 402, Asp85, and water 401, is visible in this view. Water 501, which connects the peptide CO of Ala215 with the indole NH of Trp182, is also visible. The corresponding omit map with all retinal atoms omitted from the model still features a hole in the b-ionone ring, and can be viewed at http://anx12.bio.uci.edu/ hudel/br/1.55/ret omitmap.gif.

(b) Region of Arg82 in the extracellular half channel (b) Region of Arg82 in the extracellular half channel. In the top portion, the guanidinium moiety is connected to the Schiff base via water 406, water 401, and Asp85 (see also Figures 2 and 3(b)). Water 407 further stabilizes the positive charge by accepting hydrogen bonds from both guanidinium nitrogen atoms. In the bottom portion, the connection to the extracellular surface continues via water 403, water 404 (not visible from this angle), Glu194 and Glu204. An omit map of this region, with all Arg82, Glu194 and Glu204 side-chain atoms and surrounding water molecules omitted from the model, can be viewed at http://anx12.bio.uci.edu/hudel/br/ 1.55/r82 omitmap.gif.

Il retinale è sintetizzato a partire dalla vitamina A

Il gruppo prostetico della batteriorodopsina il trans-retinale nella BR forma una base di Schiff con K216 L’assorbimento di luce induce una isomerizzazione trans-cis 1c8r 1c8s Luecke et al.Science 1999, 286, 255-260

La fotoisomerizzazione del retinale eliche G trans-retinale K216 11 13 9 7 hn K216 13 13-cis-retinale pdb: 1c8r e 1c8s

Ogni pompa ionica deve fornire un accesso alternato allo ione da trasportare sui 2 lati della membrana

Nella batteriorodopsina il retinale interrompe la continuita’ fra 2 emi-canali che connettono lo spazio citoplasmatico (alto) allo spazio extracellulare (basso) luce

Il fotociclo

Lo spettro di assorbimento dipende dall’intorno del cromoforo Lo spettro di assorbimento dipende dall’intorno del cromoforo. Un esempio il triptofano

lato citoplasmatico H+ H+ lato extracellulare K216 D96 K216 D85 ms fs retinale tutto trans H+ K216 D96 retinale 13-cis K216 D85 ms fs retinale R82 ms ps E194 E204 ms μs H+ μs lato extracellulare

luce