Danio rerio (Zebrafish) - Acque tropicali India e Sud-Est Asia - Fecondazione esterna, uovo ed embrione trasparenti - Sviluppo molto rapido: dopo 24 h dalla fertilizzazione tutti gli organi sono formati - Dopo 3 gg dalla fertilizzazione esce dall’uovo - Dopo 3-4 mesi raggiunge maturità sessuale - Una femmina produce fino a 200 uova/settimana Uova fecondate a diversi stadi dello sviluppo Adulto = lunghezza 3 cm

Tavares B. et al Danio rerio (Zebrafish)

Danio rerio (zebrafish) Vantaggi - Sviluppo rapido e alto numero di uova - Facilità di osservare lo sviluppo di tutti gli organi - Rappresentatività di tipi cellulari, organi e sistemi fisiologici - Facilità di manipolazione genetica e sperimentale - Bassi costi di mantenimento - Eccellente potenzialità per esperimenti High- Throughput - Disponibilità di oltre 1000 linee transgeniche o mutanti ( Svantaggi - Duplicazione dell’intero genoma (avvenuto nei teleostei) (ma in alcuni casi una copia è diventata pseudogene) - I mutanti embrionali sopravvivono anche in presenza di grosse malformazioni (morte in utero nei mammiferi) - Difficoltà di studio comportamenti cerebrali complessi

Pubblicazioni topo ratto cane Drosophila zebrafish C. elegans Progenitore comune: 340 mln anni fa

GENETICA CLASSICA (FORWARD): osservazione di un fenotipo mutante spontaneo, individuare il gene in cui si è verificata la mutazione e determinare la proteina codificata Approcci: - inducendo mutazioni a caso nel genoma e cercando il gene associato al fenotipo - con inserzione casuale di sequenze retrovirali o trasposoni GENETICA INVERSA (REVERSE): conoscendo una molecola (sequenza di DNA, RNA o una proteina) cercare di capire la funzione del gene nell’organismo Approcci: - mutagenesi specifica nel gene d’interesse - creando fenocopie: stesso fenotipo mediante interferenza mRNA antisenso (mutazione non trasmissibile ad altre cellule o nella linea germinale) APPROCCI PER LO STUDIO DELLA RELAZIONE GENE-FENOTIPO

Il 70% dei geni umani ha almeno un ortologo in Zebrafish; alcuni geni assenti; alcuni molto differenziati

Strategie per la mutagenesi in Zebrafish Fino al 2000: Forward genetics con mutagenesi casuale indotta: radiazioni gamma (aberrazioni troppo grandi che coinvolgono più geni), sostanze mutagene (EMS o ENU), integrazione casuale di sequenze trasponibili o retrovirus Dal 2000 in poi: Reverse genetics con gene targeting

Produzione di mutazioni random nel genoma Trattamento di cellule staminali degli spermatogoni con radiazioni ionizzanti (raggi X) o mutageni chimici Etil-metan-sulfonato Aggiunge gruppi etilici a guanina o timina e determina appaiamenti non corretti. Ciclo successivo cambiamento coppia di basi

N-etil-N-nitrosourea Produzione di mutazioni random nel genoma Modifica la coppia A-T Anni ‘90: caratterizzati circa 4000 fenotipi con alterazioni embrionali per: Gastrulazione, sviluppo di somiti e strutture cranio-facciali, cervello, apparato cardiovascolare

PRODUZIONE DI MUTAZIONI IN ZEBRAFISH Genetica classica (Forward genetics) - Produzione di mutazioni random nel genoma con sostanze mutagene (spermatozoi con mutazione m X cellule uovo +) - Individuazione fenotipi mutanti (+/m) (F1) (mutazione in eterozigosi) - Incrocio di fenotipo mutante (+/m) X (+/+) wt - Analisi fenotipica della progenie (F2) e identificazione del gene candidato con marcatori genetici disponibili (microsatelliti, RFLP, SNP) (analisi di linkage): positional cloning - Clonaggio del gene (da librerie genomiche) e sequenziamento - Eventuale selezione individui e incroci (+/m) X (+/m) per generare linee omozigoti m/m (F3) - Analisi del fenotipo

Mutagenesi casuale attraverso trattamento con ENU ENU sciolto in acqua Mutazioni random c. germinali Si stima una mutazione per genoma Incrociati più volte tra di loro per produrre omozigoti In caso di fenotipicamente normali si incrociano con wt per individuare geni con effetti materni su precoci stadi embrionali Individuazione del locus mutato Se fenotipo rilevabile: incroci con +/+, analisi di linkage con marcatori polimorfici; identificare il locus mutato in librerie DNA genomico

Esempio di linkage in un albero genealogico ++ m+ m = allele fenotipo mutato; + = allele wildtype Locus A = marcatore polimorfico m+ ++

Mutagenesi casuale per integrazione casuale retrovirale Solo alcuni embrioni avranno c. germinali mutate = founder founder X wt o founder X founder Linked-Mediated PCR PCR INVERSA Individuazione del locus mutato sequenziamento intensivo per identificazione del locus con mutazione

Linked-mediated (LM) PCR Prodotto PCR clonato e sequenziato Sequenza vettore retrovirale DNA polimerasi

PCR INVERSA

Mutagenesi inserzionale casuale: strategia per l’identificazione del tratto di DNA in cui si è inserita la sequenza esogena (trasposone o retrovirus)

A = mutaz. dominante: Pinne molto lunghe C= corpo curvo, edema Intorno al cuore B = bubble brain D= ritardo sviluppo e locomozione WT J = difetti di pigmentazione Ingrandimento embrione J Mutanti per inserzione retrovirale Alterazioni struttura occhio

PRODUZIONE DI MUTAZIONI IN ZEBRAFISH Genetica inversa (Reverse genetics) Negli ultimi 15 anni: gene targeting di geni candidati attraverso: Mutagenesi inserzionale - Utilizzo di transgeni (ricombinazione sequenze omologhe) nelle ES (knock-in) (metodo non efficiente in zebrafish) - Utilizzo di vettori retrovirali - Utilizzo di sequenze trasponibili Silenziamento genico - RNA interference (RNAi) con dsRNA (poco efficiente) - RNAi con “morfolini” antisenso - Nucleasi a “dita di zinco” (ZFN) geneticamente modificata - TALENS (Transcription activator-like TAL effector nucleases) - CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic repeats) - TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)

Metodi di gene targeting in Zebrafish RNA interference con oligo antisenso modificati con morfolino ZNF = DNA binding protein: Nucleasi a “dita di zinco” (ZFN) TALENs = TALE proteina da un patogeno di una pianta composta da unità ripetute che si legano a nucleotidi specifici CRISPR-Cas9 = Sistema utilizzato da batteri per digerire DNA esogeno. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associata alla nucleasi Cas In Zebrafish non viene applicato il gene-target knock-out per ricombinazione omologa

RISC: RNA-induced silencing complex Studio degli effetti dell’RNA interference con produzione in vitro di trascritti antisenso

Silenziamento genico in Zebrafish con morfolino Studio degli effetti in malattie con alleli loss-of-function o dominanti negativi - RNA interference con microiniezione di dsRNA non efficaci, interferenze aspecifiche quindi tossicità per l’embrione - RNA interference con oligo morfolino antisenso: le basi non attaccate allo zucchero ribosio ma ad un anello di morfolino; legami fosforodiamidati (non fosforodiesterici) tra le basi. Struttura del morfolino - Microiniezione in embrione stadio 1/2 cellule morfolini 25 nt - Molto stabili - Si legano al 5’ del trascritto inibiscono traduzione oppure - Si legano ai siti di splicing provocando splicing alternativo Svantaggi: effetto transitorio (3-5 gg). Solo studio a livello embrionale Possibile co-iniezione di mRNA geni ortologhi umani

Nucleasi a “dita di zinco” (ZFN) geneticamente modificata

Urnov FD et al Genome editing con nucleasi a “dita di zinco” (ZFN) geneticamente modificata

FokI: nucleasi batterica isolata inizialmente dal batterio Flavobacterium okeanokoites; Composta da 2 domini separati: un dominio N-terminale (DNA-binding domain) e un dominio C-terminale per il taglio del DNA (DNA-cleavage domain) Il DNA-binding domain riconosce una sequenza non palindromica e il DNA- cleavage domain taglia il DNA in modo non specifico ad una distanza di 9-13 nucleotidi a valle del sito di legame. L’enzima FokI è attivo solo come dimero: due molecole di FokI si legano a ciascun DNA-binding domain e poi dimerizzano in modo che i due domini DNA-cleavage formino una endonucleasi funzionale

Genome editing con nucleasi a “dita di zinco” (ZFN) geneticamente modificata Assemblaggio di domini zinc-finger specifici di una regione genica Deriva dal gene FokI che codifica endonucleasi batterica di restrizione non specifica Sistemi naturali di riparo della rottura della doppia elica Unione non omologa delle estremità = Non-homologous end joining Sistema con ricombinazione omologa Microiniezione di coppie di mRNA che tradotti produrranno catena polipeptidica con domini zinc-finger e nucleasi FokI

Genome editing con nucleasi a “dita di zinco” (ZFN) geneticamente modificata

Metodo di gene targeting per inserire mutazione: conversione da allele B ad allele A (DNA esogeno come stampo) Genome editing con nucleasi a “dita di zinco” (ZFN) geneticamente modificata

INATTIVAZIONE GENICA MEDIANTE ZNF (o TALE) GENETICAMENTE MODIFICATE Coppia di mRNA microiniettati Attivazione sistemi di riparazione che genera mutazioni Individuazione DNA mutati: -alterazione del taglio di enzimi nel gene target; -digestione con enzimi che tagliano ssDNA per presenza di mismatch (CEL I o T7 endonucleases), oppure -Analisi di mismatch (heteroduplex) e sequenziamento

CRISPR-CAS9 = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associata alla nucleasi Cas9 (COMPLESSO RIBONUCLEOPROTEICO) RNA-Guided Endonuclease technology. Doppio RNA: crRNA (crispRNA) unito alla sequenza target e trascrRNA (trans activating crRNA). crRNA ibrido: lega la sequenza genica target e ibrida per complementarietà una sequenza di trascrRNA. Il complesso riconosciuto e tagliato dalla nucleasi Cas 9 Necessaria la presenza di Protospacer Adjacent Motif (PAM) Sequence. Riparo del DNA con mutagenesi Strutturale naturale

CRISPR-CAS9 = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associata alla nucleasi Cas9 (COMPLESSO RIBONUCLEOPROTEICO) Co-iniezione di RNA sintetici (naturalmente presenti in batteri) e mRNA per la nucleasi Cas9 in uova fecondate (o in vettori di espressione) gRNA = RNA guida composto in parte da crRNA e trascrRNA Introduzione diretta in cellule dei complessi ribonucleoproteici. Nature Protocols 10, 1842– 1859 (2015) doi: /nprot Published online 22 October 2015

Genome targeting con la tecnica TILLING

Metodi di gene targeting in Zebrafish

ESEMPI DI INATTIVAZIONE GENICA CON TECNICA ZNF

ESEMPI DI CORREZIONE O INSERZIONE GENICA CON TECNICA ZNF