FARMACOLOGIA APPLICATA LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo

Metodi di studio di farmaci analgesici

Esistono diverse categorie di f. analgesici: F. morfino-simili (azione centrale) FANS (azione periferica e centrale) Anestetici locali (azione periferica) F. non oppioidi ad azione centrale Metodi di studio di farmaci analgesici

L’informazione nocicettiva nasce nei sensori periferici (nocicettori) e arriva ai neuroni del corno posteriore del midollo spinale. Il dolore vero e proprio è la presa di coscienza delle informazioni nocicettive integrate a livello corticale e limbico. Struttture coinvolte nel dolore: –Corteccia anteriore cingolata –Corteccia somatico sensoriale –Corteccia prefrontale –Corteccia insulare –Ipotalamo –Talamo –Sostanza grigia periacqueduttale –Cervelletto –Gangli della base SISTEMA OPPIOIDE E CONTROLLO DEL DOLORE

Trasmissione e modulazione del dolore La percezione del dolore può essere distinta in tre fasi: 1)“Apprezzamento” del dolore nei tessuti periferici a seguito di attivazione dei sensori del dolore (nocicettori) da parte di mediatori 2)Trasmissione dell’informazione dai nocicettori stimolati al midollo spinale (corna dorsali) attraverso le fibre afferenti sensitive (C e Aδ) 3)Passaggio dell’informazione ai centri cerebrali superiori (neuroni del tratto spinotalamico) e attraverso le vie discendenti inibitorie (mesencefalo e midollo allungato) al midollo spinale Oppioidi

Controllo spinale del dolore Teoria del cancello di Melzack e Wall (1965) A livello delle corna dorsali del midollo spinale, nell’area definita sostanza gelatinosa (cellule della lamina II e III), si trova la prima stazione di controllo delle afferenze nocicettive. In questa sede si realizza un vero e proprio cancello di accesso (gate control) alle afferenze nocicettive. Un ruolo di primo piano è esercitato dagli interneuroni oppioidergici (soprattutto encefalinergici) che inibiscono il rilascio di neurotrasmettitori eccitatori dalle terminazioni delle fibre A  (mielinizzate, alta velocità di conduzione; l’attivazione determina dolore pungente e localizzato) e C (non mielinizzate, bassa velocità di conduzione; l’attivazione determina dolore sordo e continuo).

e recettori

Agonisti dei recettori oppioidi Effetti farmacologici Potente effetto analgesico Gli effetti analgesici sono dovuti alla capacità di inibire direttamente la trasmissione ascendente degli impulsi nocicettivi dalle corna dorsali del midollo spinale e di attivare i circuiti di controllo del dolore che scendono dal talamo alle corna dorsali PAG = sostanza grigia periacqueduttale NRPG = nucleo reticolare paragigantocellulare

Meccanismi dell’analgesia mediata da Agonisti oppioidi

Diversi effetti dell’attivazione dei recettori oppioidi presenti in sede post- o presinaptica. L’attivazione dei recettori   in sede postsinaptica, aumenta la conduttaza al K + determinando l’insorgenza di potenziali postsinaptici inibitori (IPSP) e conseguente riduzione della scarica dei neuroni diretti ai centri superiori. L’attivazione dei recettori      sui terminali presinaptici delle fibre afferenti nocicettive, riduce il rilascio di trasmettitori eccitatori coinvolti nel dolore (glutammato, sostanza P, acetilcolina, etc).

Meccanismo dei recettori per gli oppioidi a livello centrale

1) validità del test: il test deve poter dare un’indicazione su un eventuale utilizzazione clinica del farmaco; 2) affidabilità del test: i risultati ottenuti devono essere riproducibili nel tempo; 3) semplicità del test: lo stimolo doloroso standard deve essere ben definito per ottenere una risposta dell’animale ben evidente; 4) sensibilità del test usato: con il test scelto deve essere possibile discriminare tra dosi diverse della stessa sostanza. Scelta del test

Attività analgesica centrale

Metodo del calore radiante (tail flick) nel topo/ratto Questa metodica è impiegata per valutare il cambiamento di sensibilità al calore indotta dall’analgesico oppioide nella coda dell’animale E’ un test utile per discriminare f. analgesici oppioidi e non oppioidi Dolore Acuto PROCEDURA Per ogni dose di f. da testare si usa un gruppo di 10 topi (18-22 g) Prima della somministrazione del farmaco (veicolo/ controllo positivo) viene valutata la risposta normale dell’animale allo stimolo termico.

Il topo viene posto in un cilindro di vetro da cui fuoriesce la coda L’operatore, tenendo la coda, pone una luce (fonte di calore) diretta circa ad 1/3 della lunghezza della coda.

La reazione del topo sarà quella di: -allontanare la coda dalla fonte di calore (I) -di scappare dalla gabbia (II) Tali reazioni sono attese entro 30 secondi dall’inizio della radiazione, topi che non reagiscono entro tale tempo vengono scartati dallo studio.

Standard: morfina (2 mg/kg/sc), codeina (ED50 12mg/kg/sc) Il farmaco (veicolo/ controllo positivo) sono somministrati sia per os che s.c. con diversi regimi posologici Dopo 30, 60 e 120 minuti i topi vengono sottoposti al test Valutazione dei risultati La media dei tempi di reazione a 30, 60 e 120 minuti dopo la somministrazione del F. è paragonata a quella ottenuta al tempo zero.

analgesia  soglia dolorifica  reattività al dolore euforia attivazione dei recettori µ convulsioni inibizione rilascio del GABA sedazione depressione del locus ceoeruleus depressione respiratoria  sensibilità alla CO2 miosi eccitazione parasimatica emesi attivazione della CTZ antitosse inibizione del centro della tosse DERIVATI DELL’OPPIO SISTEMA NERVOSO CENTRALE

EFFETTI DEGLI OPPIACEI SISTEMA GASTROINTESTINALE Stomaco  secrez. HCl e motilità Intestino  secrezioni  attività peristaltica  riduzione velocità di transito

Haffner’s tail clip (pinzettamento della coda) Questa metodica è impiegata per valutare l’effetto dell’analgesico oppioide sul dolore meccanico provocato sulla coda dell’animale Procedura Per ogni dose di f. da testare si usa un gruppo di 7-10 topi (18-22 g) Prima della somministrazione del farmaco (veicolo/ controllo positivo) è valutata la risposta normale dell’animale allo stimolo meccanico Si pone una clip alla base della coda del topo e si osserva entro quanto tempo l’animale reagisce (innalzamento della coda)

Haffner’s tail clip Il farmaco (veicolo e controllo positivo) è somministrato per os o per s.c. Dopo 15, 30 e 60 minuti viene applicata la clip sulla coda (1 cm dal corpo dell’animale). Il tempo di reazione del topo viene valutato con un cronometro in grado di misurare variazioni di 1/10 di secondo. Valutazione dei risultati Il valore medio del tempo di reazione nel gruppo di controllo è considerato come riferimento (per ogni intervallo di tempo dalla somministrazione del f.) Ogni valore ottenuto maggiore di tale tempo è considerato positivo e quindi indice di analgesia. (F. di riferimento: morfina e codeina)

HOT PLATE TEST

Temperatura ~ 55°C Cut off time 60s Test ad intervalli di 15 min. Standard morfina (7.5 mg/kg/sc) o codeina (30 mg/kg/sc) Sedativi, miorilassanti o psico-mimetici causano falsi positivi Con piastra a 55.5°C si valuta l’effetto di agonisti-antagonisti oppioidi

TAIL IMMERSION Bagno d’acqua termostatato a 55°C Cut-off time 15 sec. Reazione animali naive sec. Morfina ha un ED50 di 3.5 mg/kg/sc

Attività analgesica periferica I f. analgesici ad azione periferica generalmente hanno anche azione antinfiammatoria (talvolta antipiretica). Per molti di essi il meccanismo d’azione si basa sull’inibizione della COX con conseguente riduzione della sintesi di PGs

TEST DELLA FORMALINA Modello di dolore cronico Ratti adulti, g (0.05 ml di formalina al 10% nella zampa anteriore + somm. del F s.c. o x os) Letture effettuate a 30 e 60 minuti L’animale reagisce leccando e mordendo la zampa iniettata e sollevandola da terra Standard morfina (1.7 mg/kg/sc) Questo test identifica F ad az. analgesica centrale, analgesici ad az. periferica risultano inefficaci

WRITHING TEST 0.25 ml i.p. di fenchinolone 0.02% in 1% di carbossimetilcellulosa (0.1 ml acido acetico 0.6%; Acetilcolina, bradichinina e prostaglandina E1) N = 6/gruppo L’animale reagisce al dolore con degli spasmi chiaramente visibili (writhing) L’iniezione fatta 5 min prima di iniziare il conteggio, che dura 15 minuti stiramenti gruppo controllo (C) - stiramenti gruppo trattato x 100% stiramenti C Test statistico: analisi della varianza per misure non parametriche (i campioni non si distribuiscono come una gaussiana) ED50 indometacina (1.0 di mg/kg p.o.) ED50 acido acetilsalicilico (30 mg/kg p.o.)

WRITHING TEST A seconda dell’agente irritante impiegato nel writhing si ha un maggiore coinvolgimento di un mediatore rispetto ad un altro: a.acetico 0.6% si verifica un abbassamento del pH (assimilabile ad un ulcera perforata) che stimola le fibre nervose caolino promuove il rilascio di bradichinina MgSO4 promuove il rilascio di NO

Un catetere con un palloncino dilatabile di 7.5 mm introdotto nel duodeno a mm dal piloro La distensione del duodeno determina uno stiramento tipico del writhing. Lo score si calcola nel seguente modo: 0= comportamento normale dell’animale; 1= comportamento modificato leggermente definito dalla cessazione di esplorazione, eccessiva pulizia facciale, tremore dei denti e respiro profondo; 2 = comportamento modificato definito come immobilità e/o stiramento degli arti posteriori (scompare con la rimozione dello stimolo) 3 = intensa attività visceromotoria definita come ripetitivo allungamento del corpo, estensione degli arti posteriori e del bacino. morfina ed indometacina sono attive, ma non altri farmaci coinvolti nell’inibizione delle prostaglandine, come l’acido acetilsalicilico DOLORE VISCERALE NEL RATTO

DOLORE CRONICO DOLORE NEUROPATICO –Legatura o taglio del nervo Iperalgesia ed Allodinia Artrite ed osteoartrite Iperalgesia da carragenina

TEST DI RANDALL SELITTO (ratto/topo) Questo metodo si basa sul principio che l’infiammazione amplifica la sensibilità al dolore. Tale sensibilità può essere modificata dagli analgesici non narcotici. L’infiammazione riduce la soglia del dolore percepito. Il f. analgesico tende a riportare tale soglia alla normalità

TEST DI HARGREAVES Stimolazione dei termocettori applicazione di raggi IR sulla zampa interessata Si valuta il tempo (secondi) di resistenza allo stimolo termico Su topi (25-30g) o ratti ( g) In modelli di dolore neuropatico

Von Frey Dynamic Plantar Aesthesiometer (DPA) Per valutare l’Allodinia meccanica si utilizza il von frey test Von Frey Hairs (with grid)

Dolore Osteoarticolare P.A.M. Pressure Application Measurement

Incapacitance Tester Distruzione del peso sulle zampe: l’animale con dolore (neuropatico o infiammatorio cronico) tende a poggiarsi su una delle due zampe (quella “sana”)

FINE