(2012/2013) LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGICHE DEL FARMACO INSEGNAMENTO DI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI NAPOLI FEDERICO II Titolare Dr. Roberto Russo FARMACOLOGIA APPLICATA

PLACCHE DI AMILOIDE: depositi amorfi extracellulari di proteina  -amiloide (A  ) sotto forma di placche GROVIGLI NEUROFIBRILLARI: intreccio intracellulare di neurofibrille formate da proteina TAU anomala Patologia della malattia di Alzheimer

Sono ammassi di sottili filamenti (7-10 nm) che si formano nello spazio extracellulare nel cervello dei malati di AD. Sono costituiti da una forma insolubile del peptide che deriva dalla proteina precursore del  -amiloide (APP) e queste placche possono avere un nucleo denso centrale. Una porzione variabile di tali placche contengono anche altre molecole proteiche e non, e possono essere associate a cellule non neuronali e a processi neuritici anormali. Placche di amiloide Colorazione rosso congo

I grovigli neufibrillari sono dovuti a fasci di filamenti insolubili che derivano da alterata fosforilazione delle proteine TAU, associate al citoscheletro dei neuroni, che si accumulano nel corpo neuronale L’iperfosforilazione riduce l’affinità delle TAU per i microtubuli causando una perdita di stabilità nel neurone e può portare alla modificazione del metabolismo dell’APP GROVIGLI NEUFIBRILLARI

Causa dell’accumulo delle Placche Due cause principali dell’accumulo delle placche: 1.Forme dominanti della malattia associate alla disfunzione dei geni che controllano il metabolismo della proteina amiloide:  -,  -, and  - secretasi e preseniline 1 e 2 2.Forme non dominanti della malattia (incluse le forme sporadiche) che coinvolgono i meccanismi della rimozione della A .

Blu  PS1 Verde  APP Rosso  Mutazioni Giallo  sito attivo Il precursore dell’amiloide La proteina precursore dell’amiloide viene normalmente degradata per l’azione di una serie di proteasi, chiamate secretasi:  -,  -, e  -secretasi che tagliano la proteina in sequenze specifiche (vedi forbici) Queste proteasi sono sotto il controllo di due altre proteasi: le preseniline 1 e 2 Mutazioni nelle preseniline,  -,  -, e  -secretasi o nella APP stessa determinano l’accumulo extracellulare di A  sono causa di malattia.

APP processing and Aß accumulation Mature APP (center, inside dashed box) is metabolized by 2 competing pathways: A) the  -secretase pathway that generates sAPP  and C83 (also known as CTF  ; left) B) and the ß-secretase pathway that generates sAPPß and C99 (right). Some ß-secretase cleavage is displaced by 10 amino acid residues and generates sAPPß' and C89. All carboxyterminal fragments (C83, C99, and C89) are substrates for  -secretase, generating the APP intracellular domain (AICD) and, respectively, the secreted peptides p3 (not shown), Aß (right), and Glu11 Aß. Aß aggregates into small multimers (dimers, trimers, etc.) known as oligomers. Oligomers appear to be the most potent neurotoxins, while the end stage senile plaque is relatively inert.

La  -secretasi sono sotto l’influenza della PS1 e PS2 (complesso enzimatico) Mutazioni in queste proteine aumentano la produzione di A , fornendo un legame patogenico per la deposizione di amiloide; Le preseniline presentano siti per il taglio da parte delle proteasi caspasi che vengono attivate durante l’apoptosi; Preseniline e neurotossicità

Rimozione dell’amiloide Ruolo dell’ApolipoproteinaE (ApoE) ApoE: Proteina plasmatica implicata nel trasporto del colesterolo Nel SNC interviene nei meccanismi di crescita e riparazione dopo un danno Nell’AD la ApoE è legata alle placche di A  e ai grovigli neurofibrillari ApoE inibisce la formazione di fibrille di A , ma perde efficacia se associata ai lipidi I peptidi amiloidi interagiscono direttamente con ApoE legandovisi e potrebbero essere poi trasportati all’interno delle cellule neuronali via recettori per ApoE Nei cervelli di soggetti sani ApoE si lega e sequestra A  in modo più efficiente che in quelli dei malati di AD La deplezione di colesterolo comporta una riduzione nella produzione e nel rilascio di A 

Possibili cicli patogenici di produzione, clearance e degradazione di A . I complessi ApoE-A  e  2M-A  possono essere internalizzati da LRP, quindi vengono degradati nel lisosoma o trasferiti nel plasma. All’esterno della cellula  2M-A  può legare una proteasi che degrada A  oppure può essere degradato da proteasi libere.

L’ipotesi colinergica della malattia di Alzheimer si fonda sulla scarsa rilevazione di marker colinergici e su un ridotto numero di neuroni colinergici e di recettori nicotinici dell’acetilcolina nell’ippocampo e nella corteccia cerebrale.

Terapia farmacologica nel morbo di Alzheimer Terapie puntano ad un potenziamento del tono colinergico Inibitori dell’Ach esterasi (tacrina-velnacrina) unici in terapia Potenziatori del rilascio di Ach (idergina) Lecitincolina Vaccini anti  -amiloide Inibitori delle secretasi FANS Antiossidanti

Creazione di modelli animali per la malattia di Alzheimer

Topi transgenici che esprimono la β-amiloide… Per studiare gli effetti di questa proteina e come poter curare questa patologia, dobbiamo costruire dei modelli animali. I mammiferi come cani e scimmie sviluppano queste placche ma per problemi di vario genere non possono essere utilizzati. Per questo motivo creiamo dei topi in grado di sviluppare tale aggregati. Modifichiamo il DNA murinico che presenta, rispetto a quello umano, 3 aa diversi nella regione del precursore β-amiloide (APP) sul cromosoma 21.

Si è usato un vettore che presenta il promotore virale JCV (papovavirus umano con tropismo cervello specifico) seguito dalla sequenza umana c-term di APP.

Risultato: il topo presenta grande produzione di β-amiloide; come prova si sono fatti studi con anticorpi specifici contro il peptide β-amiloide ed analisi di southern-blot. Il DNA viene “digerito” con l’enzima EcoR1, separato poi con elettroforesi su gel di agarosio, fissato su membrana ed ibridato con una sonda specifica Il numero di copie del frammento è specifico per ogni linea transgenica; varia dalle 5 alle oltre 100 copie. Poi isolando l’RNA e facendo RT-PCR con elettroforesi ed ibridazione si è potuto provare l’espressione del transgene unicamente nel cervello.

TOPI TRASGENICI Sono modelli della patologia molto realistici quando troviamo una iper espressione delle isoforme di APP 751 e 770; in questi casi avremo depositi di β-amiloide età-dipendenti con perdita delle sinapsi. Per fare questo è stata indotta la FAD per mutagenesi sito specifica tra gli esoni 16 e 17 del cromosoma 16, in cellule staminali embrionali di topo. Il primo modello di topo transgenico di AD è stato sviluppato nel 1995 da Games usando un promotore umano (PDGF) che permette l’espressione della proteina precursore dell'amiloide (da qui il nome –PDAPP-); mostrano un aumento dell’espressione della proteina umana Aβ1-40 e Aβ1-42 maggiore di circa 5-14 volte. I topi utilizzati sono quelli del ceppo 129/Sv.

TOPI TRASGENICI Poco dopo il topo PDAPP è stato sviluppato, un altro modello di topo transgenico mutante APP umana, che sovra esprime la doppia forma mutante svedese di APP695, è stato chiamato topo Tg2576 Tg2576 topi sono simili al quelli PDAPP in tale da con la caratteristica che sviluppano depositi di placca (Aβ1-40 e Aβ1-42/43) in alcune zone speicfiche del cervello (corteccia frontale, temporale, nell’ ippocampo,e nel cervelletto.

TOPI TRASGENICI modelli Tau di topi transgenici sono stati progettati per riprodurre i grovigli neurofibrillari (NFT) spesso osservata in AD. Recentemente, un nuovo topo transgenico tau, P301S, è stato creato e dimostra una significativa formazione di NFT progressiva e perdita neuronale: la formazione di NFT si trovano nel midollo spinale, tronco encefalico, cervelletto, diencefalo e telencefalo basale

Procedure sperimentali: Morris Water Maze

Procedure sperimentali: Novel Object Recognition

Procedure sperimentali: Social Recognition

Passive Avoidance Test Ratti/Topi che passano da un compartimento illuminato ad uno oscuro dove ricevono scosse elettriche Gli animali imparano “l’esperienza” 24h prima dell’esperimento Modelli di memoria ed apprendimento

Active Avoidance Test L’arrivo della scossa (1.5 mA) al pavimento è preceduto di 5 sec da uno stimolo sonoro e/o acustico L’accensione della luce o il suono rappresentano lo STIMOLO CONDIZIONANTE (CS), la scossa elettrica è lo stimolo incondizionato (US). L’animale riceve lo CS e subito prima dell’US fugge dalla parte opposta della gabbia

Procedure sperimentali: Y- maze A B C Si basa sul comportamento di “alternanza” che caratterizza l’attività esplorativa In questo tipo di labirinto, il ratto (o topo) percorre prima un braccio e poi l’altro senza ripetere l’entrata nel braccio visitato la prima volta. Nell’unità di tempo (3-5 minuti) si contano il numero delle entrate e l’alternanza nei 2 bracci della Y. Un ratto in condizioni normali alterna mediamente 4-6 volte nei 2 bracci.

FINE

A B C Morris water maze usato per la memoria spaziale breve: Imparano x 5 giorni Probe rimuovi la piattaforma Reversal metti la piattaforma del quadrante opposto Y- maze usato per la working memory Novel object recognition usato per verificare la preferenza e quindi il ricordo del vecchio oggetto (familiare) e rispetto a uno nuovo