LE CELLULE STAMINALI: dalla ricerca di base alle applicazioni

Caratteristiche generali Hanno grande potenziale proliferativo Sono capaci di autorinnovamento Sono generalmente pluripotenti Sono presenti in tutti gli stadi di sviluppo: Embrionale (ESC) Fetale (FSC) Adulto (ASC) Provvedono: allo sviluppo embrionale e fetale alla rigenerazione ed all’omeostasi di organi adulti

Divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche

Cellule staminali embrionali (ESC)

Cellule staminali embrionali (ESC) Edwards (1967): da blastocisti di coniglio vengono ottenute cellule che, coltivate in vitro, formano aggregati (embryoid bodies) o monostrati che possono essere propagati per diverse generazioni e congelati.

(A) Embrione allo stadio di due cellule marcate in modo differenziale per seguire il destino delle cellule discendenti, (B) blastocisti, polo embrionale — in alto —, polo abembrionale — in basso (da PEARSON H., Developmental Biology: your destinyfrom day one, Nature 2002, 418: 15) 

Evans e Kaufman (1981): coltivano blastocisti di topo, ottenendo ESC pluripotenti.

Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts Science, Vol 282, Issue 5391, 1145-1147 , 6 November 1998 Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts James A. Thomson, * Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall, Jeffrey M. Jones “…These cell lines should be useful in human developmental biology, drug discovery, and transplantation medicine.”

Cellule staminali pluripotenti umane (ESC, EGC,ECC)

Applicazioni terapeutiche delle ESC

Applicazioni terapeutiche delle ESC

Clonazione terapeutica

Cellule staminali adulte (ASC) La classificazione di Bizzozero (1894): tessuti ad elementi labili: epitelio germinale del testicolo, midollo osseo, milza e linfonodi, epiteli di rivestimento e loro derivati; tessuti ad elementi stabili: fegato, rene, pancreas, alcune ghiandole, tessuti connettivi e muscolo liscio; tessuti ad elementi perenni: muscolo striato scheletrico e cardiaco, tessuto nervoso; E’ oggi superata dalla dimostrazione che, anche in quei tessuti, considerati privi di cellule mitotiche allo stadio adulto, sono presenti cellule staminali.

Tipi di ASC nei mammiferi Le più studiate: cellule staminali ematopoietiche e germinali maschili; Le sorelle delle ematopoietiche: cellule staminali endoteliali; Le più versatili: cellule staminali mesenchimali; Le meno versatili: cellule staminali epidermiche; Le più recenti: cellule staminali neurali e germinali femminili; Le più sconosciute: cellule staminali epatiche, pancreatiche e renali.

Caratteristiche delle ASC Le ASC sono cellule quiescenti e con fenotipo differenziato: per questo è difficile identificarle in vivo, in condizioni normali. Sono capaci di autorinnovamento, dividendosi sia simmetricamente che asimmetricamente. In base al tessuto di appartenenza, hanno un tasso di proliferazione diverso. In base al tessuto di appartenenza, hanno un fenotipo diverso. In base al tessuto di appartenenza, sono uni- o pluripotenti. L’idea che le ASC siano cellule “primitive” e indifferenziate è superata.

La nicchia Microambiente tessuto-specifico ove si realizzano condizioni “embrionali” in grado di mantenere lo stato staminale delle ASC, controllarne la proliferazione e indirizzarne il differenziamento. Cellule mesenchimali non staminali, dette cellule della nicchia, interagiscono con le ASC, attraverso giunzioni intercellulari, secrezione di molecole segnale e di componenti della matrice extracellulare (ECM).

Nicchie germinali testicolo di mammifero; testicolo ed ovario di Drosophila; gonade ermafrodita di Caenorabditis.

Nicchie somatiche Epidermide e annessi; Cripte intestinali; Ematopoietiche: nel midollo osseo, a contatto con osteoblasti; Neurali: in prossimità dei ventricoli, a contatto con cellule ependimali; Nel rene si pensa che la nicchia risieda nella papilla.

La nicchia Conoscere le nicchie permette di comprendere la regolazione normale delle attività delle ASC e la disregolazione in patologie, come cancro e malattie degenerative; permette di riprodurre in vitro il microambiente; può costituire un bersaglio nelle applicazioni terapeutiche delle ASC.

Caratteristiche molecolari delle nicchie Molecole segnale e morfògeni prodotti dalle cellule della nicchia: FGF, EGF, necessari per stimolare la proliferazione; superfamiglia del TGFβ (BMPs; Noggin), indirizzano il differenziamento. Recettori e vie di segnalazione intracellulare sulle ASC: FGFR; TGFR; Shh, importante per il mantenimento dello stato staminale; Wnt, implicato nella scelta di specifiche vie differenziative; Notch, implicato nella divisione asimmetrica.

Caratteristiche molecolari delle nicchie Componenti del glicocalice e della matrice extracellulare e relativi recettori: Integrine; laminina, fibronectina, tenascina; proteglicani; PSA-NCAM; LeW/SSEA. Molecole delle giunzioni aderenti: N-caderina, presente sia nelle cellule staminali ematopoietiche, che neurali; E-caderina, presente nelle cellule staminali epiteliali, ma anche nella ICM; Β-catenina, implicata sia nelle giunzioni aderenti, che nella via di Wnt.

Plasticità delle ASC Molte ASC posseggono un’ampia “potenza” di sviluppo e differenziamento (plasticità). Tale plasticità è influenzata da fattori estrinseci. La plasticità può essere “intragerm layer” o travalicare i confini dei foglietti germinali. Le più plastiche sono le MSC, ma anche le NSC sono capaci di conversione“transgerm layer”.

Plasticità delle ASC

Possibili meccanismi di plasticità Presenza nel tessuto di SC con diversa potenzialità; Fusione tra SC e cellule del tessuto; Transdifferenziamento, sdifferenziamento-redifferenziamento; Presenza di cellule pluripotenti nei tessuti adulti.

CELLULE STAMINALI NEURALI

Il tessuto del sistema nervoso maturo è stato per lungo tempo considerato incapace di rinnovarsi e rimodellarsi, soprattutto nei mammiferi. Fino a non molto tempo fa si pensava che la genesi di neuroni e glia nel sistema nervoso centrale maturo terminasse precocemente, nel periodo postnatale

Il cervello dei mammiferi si sviluppa come tubo neurale contenente una cavità ventricolare riempita di fluido cerebrospinale. I precursori neurali proliferanti risiedono inizialmente nello strato di cellule luminali (zona ventricolare, VZ); in seguito, man mano che lo sviluppo procede, essi si ritrovano nella zona subventricolare (SVZ) che si forma immediatamente vicino. La VZ scompare gradualmente, sopravvivendo nell’adulto come un monostrato di cellule continue che delineano le cavità ventricolari (strato ependimale, EL) .

La SVZ persiste nei mammiferi neonati ed adulti come uno strato mitoticamente attivo, adiacente alla zona ependimale che circonda i ventricoli laterali del cervello; da molto tempo si ipotizza che tale zona possa dare origine a cellule gliali nel cervello postnatale ed adulto .

NEUROEPITELIO OLFATTIVO GENESI DI NUOVE CELLULE NEL SNC POSTNATALE E ADULTO UNA PROTRATTA NEUROGENESI CARATTERIZZA ALCUNE REGIONI DEL CERVELLO DEI MAMMIFERI DURANTE IL PERIODO POSTNATALE (CELLULE DELLO STRATO GRANULARE ESTERNO DEL CERVELLETTO). NEL SNC ADULTO UNA PERSISTENTE NEUROGENESI APPARE RISTRETTA IN TRE SITI: NEUROEPITELIO OLFATTIVO BULBO OLFATTIVO IPPOCAMPO AREE NEOCORTICALI ASSOCIATIVE (PREFRONTALE, TEMPORALE INFERIORE, PRIETALE POSTERIORE), SOLO NEI PRIMATI

FATTORI DI CRESCITA Gli stessi fattori di crescita che regolano lo sviluppo dei precursori embrionali potrebbero controllare la proliferazione dei progenitori nel SNC maturo. Per esempio, il fattore di crescita epidermico (EGF) stimola la proliferazione di cellule multipotenti sia nel SNC embrionale sia nel SNC adulto. Anche il fattore di crescita fibroblastico basico (bFGF) stimola la proliferazione di vari precursori embrionali neurali. Recentemente, è stato osservato che cellule staminali isolate dallo striato adulto di topo e coltivate in vitro, generano precursori che proliferano quando esposti al bFGF

Neurospheres grown in EGF and bFGF and stained for nestin (B)

Differenziamento in vitro di neurosfere in neuroni (A,B,D,E) astrociti (B,F) oligodendrociti (G, H)

E’ importante sottolineare che non tutte le cellule di una neurosfera sono cellule staminali; infatti solo una piccola percentuale di esse conserva la staminalità mentre le restanti cellule vanno incontro a differenziamento spontaneo. Una neurosfera è quindi un miscuglio di cellule staminali, progenitori e cellule differenziate Questo è il motivo per cui le neurosfere vengono subcoltivate mediante raccolta e dissociazione meccanica e quindi riseminate nelle medesime condizioni di coltura.

A cluster of neural cells were derived from human embryonic stem cells A cluster of neural cells were derived from human embryonic stem cells. The motor neurons are shown in red; neural fibers appear green and the blue specks indicate DNA in cell nuclei.

POTENZIALITA’ TERAPEUTICHE DELLE NSC E’ stato dimostrato che le cellule staminali neurali riconoscono e migrano verso i tumori cerebrali. Questa abilità migratoria le rende vettori ideali per veicolare farmaci a livello della zona tumorale. Studi condotti su topi, utilizzando questo approccio sperimentale, hanno dimostrato una riduzione della massa tumorale dell’80%. Queste scoperte appaiono particolarmente interessanti perché aprono nuove possibilità terapeutiche nella lotta ai tumori maligni cerebrali le cui cellule appaiono altamente aggressive e invasive.

La cellula staminale tumorale (TSC)

Tumori cerebrali e cellule staminali

Tumori cerebrali e cellule staminali

Terapie antitumorali e TSC

Applicazioni terapeutiche delle SC Rivascolarizzazione organi ischemici Malattie neurodegenerative Invecchiamento Infarto del miocardio Malattia coronarica Distrofia muscolare Diabete di tipo 1 Terapie geniche (malattie del sangue)

Terapie staminali: il futuro Supporto inerte Cellule staminali epidermiche Cellule staminali epidermiche Seminato con fibroblasti Espansione delle cellule staminali Trapianto in vivo Midollo osseo Cellule staminali ossee Espansione delle cellule staminali Adesione a particelle di idrossiapatite/fosfatotricalcico Trapianto in vivo

Ricerca di base ed applicata La comprensione dei meccanismi che regolano la persistenza delle ASC, il self renewal, le proprietà di migrazione e la scelta tra diversi programmi di differenziamento è essenziale affinché queste cellule possano essere usate in sicurezza per applicazioni terapeutiche.

Considerazioni etiche e sociali sull’uso di hESC Consenso informato per chi dona gli oociti Uso di embrioni congelati (derivanti da IVF) La blastocisti è già un essere umano? L’utilizzo terapeutico può incidere sul giudizio etico? Produzione di “embrioni” mediante clonazione terapeutica Cellule staminali “clonate” possono costituire una terapia realistica? Solo per pazienti ricchi? Farmaci immunosoppressori o cellule staminali geneticamente modificate.

Glossario