Tecniche analitiche Nozioni teoriche fondamentali sulle quali sono basate le tecniche Descrizione della strumentazione Applicazioni delle tecniche esaminate Limiti e vantaggi Nella presente lezione verranno prese in considerazione le tecniche analitiche di uso nei laboratori clinici 1

Tecniche analitiche - basate su interazioni energia radiante –materia - tecniche elettrochimiche (elettroforesi, elettrofocalizzazione) Tecniche immunochimiche ( antigene-anticorpo, marcatori)

Tecniche basate su interazione energia radiante-materia SPETTROMETRIA TORBINOMETRIA NEFELOMETRIA FLUORIMETRIA LUMINESCENZA

Corpuscolare ( fasci di fotoni) onda elettromognetica Energia radiante Corpuscolare ( fasci di fotoni) onda elettromognetica

Energia radiante E= v h , l = c/v h = costante di Planck 6,63 10-27 erg v= frequenza di oscillazioni x sec. c= velocità della luce cm/sec l = lunghezza d’onda in A= 10-8 cm oppure in nm ( 1 nm= 10-9m)

Interazione energia radiante -materia L’energia di un corpo non può variare con continuità , ma un corpo può acquistare energia solo in maniera discontinua attraverso l’acquisto o la cessione di “ quanti” di energia Le transizioni dallo stato fondamentale a quello eccitato e viceversa producono spettri diversi

Spettro di assorbimento e di emissione Se gli e di un composto passano dallo stato fondamentale a quello eccitato assorbendo un quanto di energia ( spettro di assorbimento) Se gli e cedono un quanto di energia x ritornare nello stato fondamentale ( spettro di emissione)

Misura dell’energia radiante Se Energia luminosa emessa da una sorgente radiante e parzialmente viene assorbita dalla materia a livello atomico (spettrometria atomica), a livello molecolare (spettrometria di assorbimento nel VISIBILE E UV), materia in fine sospensione in un fluido (torbinometria) La maggior parte dei metodi clinici si basano sull’interazione della materia con l’energia radiante. Le misure si riferiscono a radiazioni… 8

Perché sono importanti le Proprietà spettrali Ogni classe di molecole a seconda dei legami che la compongono e della sua massa atomica assorbe a lunghezze d’onda specifiche. Proprietà spettrali di una molecola sono la firma della molecola stessa. Proprietà spettrali servono per un’analisi qualitativa ( x distinguere i composti tra di loro) e quantitativa

Uso della spettrometria Determinazione della concentrazione delle proteine Determinazione dell’attività enzimatica Determinazione di costanti cinetiche

Determinazione della concentrazione delle proteine Misura nell’UV Misura nel Visibile mediante metodi colorimetrici

Legge di Lambert -Beer A = log10 (I0/I) = e c l e coefficiente di estinzione (dipende da l) c concentrazione l cammino ottico Cammino ottico

Spettrofotometro Sorgente luminosa ( lampade deuterio x UV, tungsteno nel VIS) Monocromatore ( prisma a quarzo) Celle di lettura ( cuvette) Fotorivelatore ( trasforma l’energia trasmessa in energia elettrica) Sistema di misura e registrazione

Determinazione concentrazione proteica nell’UV ad una l fissa Preparazione di una soluzione di proteina a concentrazione nota ( riferimento Assorbimento della proteina di riferimento a concentrazione nota o della quale è noto e e di quella a concentrazione incognita ad una l di 280nm Proporzione Ar: Cr= Ap: Cp

Determinazione concentrazione proteica in un intervallo di l - Spettri d’assorbimento Misurare l’assorbimento di un composto in un range di lunghezze d’onda 220nm a 320nm Considera il massimo di assorbimento Determinare la concentrazione di proteine e acidi nucleici, riferendosi ad una soluzione a concentrazione nota o della quale è noto e

e%l Quando non è noto e e1%280 = 0,4OD Una soluzione di riferimento 1% ( 1g/100ml) assorbe 0,4OD Proporzione x determinare la concentrazione di una soluzione a concentrazione incognita

Metodi colorimetrici Miscele proteiche reagiscono con reattivi e si sviluppa un colore L’intensità del colore è direttamente proporzionale alla concentrazione La misura dell’assorbanza viene effettuata dopo un tempo prestabilito, x essere sicuri che la reazione è completata Utilizzo di una soluzione proteica a concentrazione nota per costruire una retta standard Assorbimento nel VIS

Composizione chimica e colore Il colore di un composto chimico dipende da: Cromofori: gruppi chimici con legami insaturi, cioè caratterizzati da elettroni insaturi

CURVA STANDARD di BSA e calcolo della concentrazione di una soluzione proteica ad una l fissa BSA= 1mg/ml Pendenza retta = 0,04 A della soluzione incognita è 0,5 OD Calcola la sua concentrazione?

Biureto In soluzione alcalina sostanze contenenti almeno due legami peptidici formano complessi blu-porpora (540 nm) con il rame • Metodo selettivo, poco sensibile (ottimo per campioni ad alta concentrazione: proteine del siero, negli alimenti)

Metodo di Lowry Il rame in cond. alcaline si complessa alle proteine• Il reattivo di Folin reagisce con gruppi fenolici (tirosine) Sensibile; colorazione blue, Assorbimento a 770nm

BCA ASSAY KIT E’ un kit che contiene 2 soluzioni, Reagente A e B, che vanno mescolati prima dell’uso in un rapporto1:50 Si può utilizzare una piastra a 96 pz, si aggiungono 200 ml diBCA mix, ed generalmente 1 ml di estratto proteico. Si incuba 30 min a 37° e si effettua una lettura a 562 nm

Metodo di Bradford o Biorad Comassie forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite legami elettrostatici con i gruppi amminici e carbossilici e tramite forze di Va der Waals assorbimento a 595nm ( blue)

Metodi spettrofotometrici x dosare l’attività enzimatica

Che informazione otteniamo dalla cinetica enzimatica Enzima monomerico Enzima è allosterico

EFFETTO [S] Reazione catalizzata Reazione non catalizzata

Inibizione competitiva

inibizione non competitiva

INIBIZIONE IRREVERSIBILE Sono inibitori che si legano o che distruggono il gruppo funzionale dell’enzima che è indispensabile per la sua attività catalitica, o che si legano con un legame non covalente particolarmente stabile.

Cinetica x Studio del pH e T ottimale

Cinetica di ENZIMI REGOLATORI

Cinetica sigmoidea

Dosaggio enzimatico Scomparsa di S Comparsa di P T e pH ottimali ( miscela di reazione) Metodi di cinetica continui Metodi di cinetica a tempi fissi

Cinetica continua e a tempo fisso Cinetica continua: Si misurano le variazioni di assorbanza per tutto il tempo che si ritiene opportuno Cinetica a tempi fissi: a tempi prestabiliti si prelevano aliquote dalla miscela di reazione x misurare l’assorbanza

Condizioni x misurare l’attività enzimatica? 1: S e P devono assorbire a diverse l Valida la legge di Lambert-Beer Concentrazione di S saturante Controllo ( reazione in assenza di E o di S)

Dosaggi enzimatici spettrofotometrici Molti S e P assorbono nel VIS o nell’UV Molti dosaggi si basano su: Interconversione di NAD(P)/ NAD(P)H, catalizzate da deidrogenasi (reazioni di ossido-riduzione) Sia la forma ridotta che ossidata assorbono a 260nm, solo la ridotta a 340nm

Calcolo delle unità enzimatiche U= DE340nm x a x 1000 e 1000 x a= volume totale della miscela di saggio X = volume del campione presente nella miscela di saggio

Analisi enzimatica nella diagnostica clinica Contribuisce ad una diagnosi di malattie che hanno sintomi simili Variazione di espressione e/o di attività degli enzimi o proteine

Enzimi più saggiati in biochimica clinica Glutammato ossalacetato transaminasi ( GOT) Creatina fosfochinasi (CPK) Lattato deidrogenasi (LDH) Fosfatasi alcalina (AP)

Diagnosi Infarto dl miocardio: elevati livelli di GOT,CPH, LDH Embolia polmonare: elevati livelli di LDH

Determinazione dell’attività enzimatica mediante saggi accoppiati Reazioni accoppiate: se la reazione non produce un composto colorato si accoppia con una reazione che produce un composto colorato

Saggi accoppiati A( non colorato)+ B( non colorato) C ( colorato) la quantità di C è equivalente alla quantità di A

Saggi accoppiati con enzimi che richiedono nucleoitidi piridinici ( NAD, NADH, NADP, NADPH): coinvolti in reazioni di ossido riduzioni RH2 + NAD R+ NADH + H+ La concentrazione di RH2 può essere misurata mediante spettro di assorbanza di NADH

Dosaggio spettrofotometrico del NADH La riduzione del NAD+ a NADH determina un aumento dell’assorbimento a 340 nm, viceversa il consumo di NADH determina una diminuzione dell’assorbimento a 340 nm: queste misure di assorbimento si fanno allo spettrofotometro. Anche una reazione non deidrogenasica può essere seguita allo spettrofotometro, se viene accoppiata ad una deidrogenasica (NAD-dip), tramite un intermedio comune: A + B  C + D C + NAD+  F + NADH

Torbinometria Misura la luce assorbita da parte di un sistema eterogeneo (precipitato disperso in un mezzo liquido). C e A ssorbanza della sostanza in sospensione seguono la legge di Lambert-Beer Massima sensibilità è UV, ma… Sul plasma l’assobimento avviene a 500nm x evitare interferenze dell’emoglobina e bilirubina

Difficoltà Preparazione di sospensioni stabili e riproducibili Difficile standardizzare le Dimensioni delle particelle

Nefelometria I= K NV2 I0 r2 l4 determinazione di fasi disperse molto fini Si misura la luce diffusa, con nefelometri L’intensità della luce diffusa è proporzionale alla concentrazione della fase dispersa I= K NV2 I0 r2 l4 I= KN quando V I0 l e r definite, I proporzionale a N I= intensità della luce diffusa I0= intensità della luce incidente N= numero di particelle disperse V= volume delle particelle r= distanza del fotomoltiplicatore dalla cuvetta K= costante

Applicazioni Proteine del plasma, lipoproteine, proteine urinarie,

Spettroscopia di riflettanza differenze con la spettroscopia di assorbimento Spettroscopia di assorbimento x misura: di composti colorati naturalmente o composti suscettibili di sviluppare colore in soluzioni Linearità tra assorbanza e concentrazione Spettroscopia di riflettanza x misura: di composti che diventano colorati ma non in soluzione, ma la reazione di colorazione avviene su un supporto

Come e dove avviene la reazione di colorazione? voglio dosare un composto presente nel plasma o urine Pongo il plasma su un supporto (cellulosa, , film di materiale plastico) Sul supporto ci sono zone precise “ zone reattive” impregnate di una sostanza in grado di reagire con l’analita da dosare e sviluppare colore Intensità del colore prodotto è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita Strumenti misurano luce riflessa dalla macchia colorata

Fluorimetria Metodo ottico x analisi qualitativa e quantitativa di sostanze fluorescenti Sostanze fluorescenti sono capaci di assorbire radiazione ad una certa l ( luce eccitante) e di riemettere le radiazioni a l maggiore (luce fluorescente)

Sostanze fluorescenti Sostanze con doppi legami coniugati, Sostituenti chimici –OH, -NH2, -NHR Assorbono fra 250 e 600-700 nm ( spettro di eccitazione) Riemettono a l superiore ( spettro di emissione)

Relazione tra intensità di fluorescenza e C F= I0 abco F= intensità della luce fluorescente I0= intensità luce eccitante a= coefficiente di assorbanza molare b= cammino ottico dipende dalla cella di misura c= concentrazione della sostanza che fluorescente o = efficienza quantica ( da 0a 1) Per soluzioni sufficientemente diluite l’intensità di fluorescenza è direttamente proporzionale alla concentrazione della sostanza fluorescente

Fluorimetri Sono uguali agli spettrofotometri però il fotorivelatore è posto a 90° rispetto all’asse della sorgente luminosa, in modo che il fluorimetro venga colpito solo dalle radiazioni emesse dal campione fluorescente.

Sensibilità e specificità dei fluorimetri 1000-10.000 volte più sensibili dei metodi fotometrici Specificità è paragonabile Curva standard

Applicazione Diretta : sostanza da dosare è autofluorescente in condizioni adatte (porfirine, barbiturici) Indiretta : sostanza da dosare non è autofluorescete ma lo diventa reagendo con determinati reagenti ( reazioni di ossidazione)

Applicazione Dosaggio cortisolo, estrogeni, catecolamine, tiamina, calcio

Luminescenza Emissione di luce nel visibile da parte di una molecola quando gli elettroni passano dallo stato eccitato a quello fondamentale. se lo stato eccitato viene prodotto da una reazione chimica (Chemiluminescenza) se viene prodotto da una reazione catalizzata enzimaticamente(luciferasi) (Bioluminescenza)

Chemiluminescenza Esempio: dosaggio di perossido a 430nm Composto CLridotto + H2O2 composto CL ossidato+ fotone catalizzatore CL: sostanza adatta x chemiluminescenza : luminolo, isoluminolo, lucigenina

Applicazioni della chemiluminescenza Determinazione di attività enzimatiche ( ossidasi specifiche) Determinazione di substrati ( glucosio, acido urico, colesterolo)

Bioluminescenza Metodo ad alta sensibilità Reazione x dosare ATP o enzimi ATP dipendenti: luciferasi catalizza l’ossidazione della luciferina in presenza di ATP Luciferina + ATP+ O2 ossiluciferina+ AMP+PP+ fotone luciferasi Luciferasi estratto dalla lucciola X dosare enzimi in reazioni accoppiate

Esempio: dosaggio della malico deidrogenasi Malato+ NAD ossalacetato + NADH + H+ ossidoreduttasi NADH + H+ + FMN FMNH2 + NAD luciferasi FMNH2 + RCHO +O2 FMN +RCOOH + H2O +luce aldeide alifatica Luciferasi utilizza FMNH2 e O2 x ossidare aldeidi alifatica FMN che si produce è accoppiato al NADH e così viene dosato la malico deidrogenasi

Applicazione della bioluminescenza 1) misura di ATP Attività ATP dipendenti ( ATP-asi, esochinasi, piruvatochinasi) Substrati di queste attività ( ADP, glucosio, fosfoenolpiruvato) Sensibilità 10-14 moli/campione