Il Sistema Modello di Caenorhabditis elegans e la scoperta dell'RNA interference e dei micro-RNA ADI a.a

“organismi modello” e “sistemi modello” vengono selezionati per studiare aspetti più semplici e maggiormente comprensibili e perché possono essere manipolati

ANNOTAZIONE DI GENOMI

2013 Rothman, Schekman, Südhof MedicinaTraffico vescicolare 2012 Gurdon, Yamanaka Medicina Riprogrammazione Cellule Staminali 2012 Lefkowitz, Kobilka Chimica Recettori accoppiati a proteine G 2011Beutler, Hoffman, SteinmanMedicina Immunità innata, cellule dendritiche 2009Blackburn, Greider, SzostakMedicina Telomeri e telomerasi 2009 Ramakrishnan, Steitz, Yonath Chimica Struttura e Funzioni dei Ribosomi 2008 Shimomura, Chalfie and Tsien Chimica Green Fluorescent Protein, GFP 2007Capecchi, Evans, SmithiesMedicina Mutazioni geniche “artificiali” nel topo 2006Fire, Mello Medicina Interferenza mediata da RNA in C. elegans 2006Kornberg Chimica RNA polimerasi II 2004Axel, Buck Medicina Recettori olfattivi 2004 Ciechanover, Hershko, Rose Chimica Ubiquitina e degradazione proteine 2003Agre, MacKinnon Chimica Canali di membrana 2002Brenner, Sulston, Horvitz Medicina C. elegans, apoptosi 2001Hartwell, Hunt, Nurse Medicina Ciclo cellulare 2000Carlsson, Greengard, Kandel Medicina Trasduzione di segnali nel Sistema Nervoso Premi Nobel di area biomedica ( )

Introduzione di Caenorhabditis elegans come sistema modello, anni '60 -Trasparente, ciclo vitale breve -Generazione di modelli genetici -Primo genoma completamente sequenziato tra gli organismi pluricellulari -L'intuizione: molto più simile a noi di quanto si potesse immaginare Sydney Brenner, born 1927, La Jolla, CA, USA.

Caenorhabditis elegans Simple organism (959 cells) Transparent Short life cycle: embryonic development (14 hours) larval development (48 hours) Genome sequence fully available from 1998 (≈ genes) Reverse genetics (Transgenics, RNA interference, KO, genetic resources)

Forward genetics: phenotypegene Reverse genetics: genephenotype Gene function

ATG TGA IIIIIIIVVVIVIIVIIIIX feh-1 UV, TMP ATG feh-1 gb561 “Genetic” silencing (KO) of a gene in C. elegans

WW N--C PTB1PTB2 IIIVIVIIVIIIIX gb561 IIIIIIIVVVIVIIVIIIIX feh-1 STOP N--C “Genetic” silencing (KO) of a gene in C. elegans

+/++/--/- Zambrano et al. (2002) J. of Cell Science “Genetic” silencing (KO) of a gene in C. elegans

+/++/--/- Genetic vs. Post-transcriptional gene silencing in C. elegans Zambrano et al. (2002) J. of Cell Science

2013 Rothman, Schekman, Südhof MedicinaTraffico vescicolare 2012 Gurdon, Yamanaka Medicina Riprogrammazione Cellule Staminali 2012 Lefkowitz, Kobilka Chimica Recettori accoppiati a proteine G 2011Beutler, Hoffman, SteinmanMedicina Immunità innata, cellule dendritiche 2009Blackburn, Greider, SzostakMedicina Telomeri e telomerasi 2009 Ramakrishnan, Steitz, Yonath Chimica Struttura e Funzioni dei Ribosomi 2008 Shimomura, Chalfie and Tsien Chimica Green Fluorescent Protein, GFP 2007Capecchi, Evans, SmithiesMedicina Mutazioni geniche “artificiali” nel topo 2006Fire, Mello Medicina Interferenza mediata da RNA in C. elegans 2006Kornberg Chimica RNA polimerasi II 2004Axel, Buck Medicina Recettori olfattivi 2004 Ciechanover, Hershko, Rose Chimica Ubiquitina e degradazione proteine 2003Agre, MacKinnon Chimica Canali di membrana 2002Brenner, Sulston, Horvitz Medicina C. elegans, apoptosi 2001Hartwell, Hunt, Nurse Medicina Ciclo cellulare 2000Carlsson, Greengard, Kandel Medicina Trasduzione di segnali nel Sistema Nervoso Premi Nobel di area biomedica ( )

RNAi è stata identificata in C. elegans Their Majesties Queen Silvia and King Carl XVI Gustaf of Sweden (middle) posing with Nobel Laureate Andrew Z. Fire and his wife, Rachel Krantz (left), and Nobel Laureate Craig C. Mello and his wife, Edit Mello (right), at the Nobel Banquet, 10 December 2006.

RNAi: Le evidenze preliminari From: Fire Nobel Lecture

RNAi: Le evidenze preliminari

From: Fire Nobel Lecture RNAi: Le evidenze preliminari

From: Fire Nobel Lecture

I “Compiti per le Vacanze” di Craig Mello From: Fire Nobel Lecture

RNAi is: From: Mello Nobel Lecture

In invertebrati RNAi si autoalimenta (RdRP)

RNAi “by feeding” DE3 strain: Timmons et al.,

From: Fire Nobel Lecture

siRNA: meccanismo d’azione

RNAi è stata identificata in C. elegans…

… ma funziona anche in cellule di mammiferi

… con corti (21-23 nt) siRNA, per impedire la Risposta a Interferone: 1)Induzione sintesi 2’-5’-oligo-A sintetasi 2)La presenza di dsRNA attiva la 2’5’-oligo-A sintetasi che procede alla sintesi di un 2’,5’-oligo-A 3) Attivazione della RNasi L ad opera dell’2’-5’-oligo-A 4)Degradazione dell’RNA ad opera della RNasi L 5)Attivazione della chinasi PKR ad opera del dsRNA 6) La chinasi PKR inibisce il fattore eIF2  fosforilandolo (INIBIZIONE DELL’INIZIO DELLA TRADUZIONE) 

miRNA ed siRNA Cellule eucariotiche complesse possono utilizzare molecole sintetiche di siRNA Qual è la funzione normale dei macchinari preposti all’utilizzo degli siRNA? Esistono molecole “endogene” simili agli siRNA? Cellule eucariotiche complesse devono possedere i macchinari adeguati

miRNA: tappe rilevanti

miRNA ed siRNA

GENES & DEVELOPMENT 21:1975–1982 © 2007 by Cold Spring Harbor Laboratory Press Biogenesi di miRNA

GENES & DEVELOPMENT 21:1975–1982 © 2007 by Cold Spring Harbor Laboratory Press miRNA: meccanismo d’azione

miRNA in malattie umane

miRNA in diagnostica avanzata

I miRNA possono essere trasferiti tra cellule attraverso esosomi

I miRNA possono essere trasferiti tra cellule attraverso esosomi e circolare nel sangue

I miRNA modulano l’espressione di geni, e quindi partecipano al delicato equilibrio tra oncogèni ed oncosoppressori miRNA (-) Prodotti dei geni OncogèniOncosoppressori

I miRNA e i loro antagonisti saranno tra i farmaci antitumorali del futuro? miRNA (-) Oncosoppressori (-) Sopravvivenza e Proliferazione (Tumorigenesi) (+) Strategia terapeutica Antagomir (-) (-) Oncogèni (+) (-) miRNA (-) mir-mimetici (+) (-)

CdL Medicina e Chirurgia, Gruppo 16 ADI 2005/2006 C. elegans, visto dai nostri Studenti

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