Studentessa: Federica Esposito matr 574/424 Anno accademico: 2008/09 Metodi di dosaggio di proteine Studentessa: Federica Esposito matr 574/424 Anno accademico: 2008/09

Per poter quantizzare la proteina di interesse è necessario disporre di un opportuno saggio che : consenta di seguire la proteina durante i vari passaggi di purificazione sia eseguibile rapidamente su molti campioni sia eseguibile su piccola quantità della proteina desiderata indichi in maniera affidabile la quantità della proteina

Spettrofotometria

La spettrofotometria è lo studio dello scambio di energia (interazioni) tra le radiazioni elettromagnetiche e la materia

Premesse… Radiazioni (o onde) elettromagnetiche Forma di energia che si propaga, anche nel vuoto:simultanea propagazione nello spazio delle oscillazioni di un campo elettrico e di un campo magnetico

Ogni radiazione è caratterizzata dai seguenti parametri: Frequenza: V Si legge ‘’ni’’ Numero di vibrazioni nell’unità di tempo Si misura in sec-1, chiamati Hertz (Hz) Periodo: T tempo occorrente per compiere una oscillazione completa è l’inverso della frequenza (T=1/V) e si misura in sec distanza tra 2 punti adiacenti in fase (ad esempio tra 2 massimi consecutivi si misura in m, micron, nanometri, ampere Lunghezza d’onda: l Si legge ‘’ lambda’’

Energia: E=h*v h indica la costante di Planck : h=6,63x10-34 J .s V= frequenza

Diversi tipi di radiazioni (differiscono tra di loro per la lunghezza d’onda)

La luce Visibile Alle diverse radiazioni visibili (rappresenta solo una piccola parte dello spettro elettromagnetico) Raggi gamma Raggi X raggi UV Visibile Raggi infrarossi Onde radio Alle diverse radiazioni visibili corrispondono i diversi colori

La luce visibile può essere: MONOCROMATICA: costituita da radiazioni di una sola frequenza e lunghezza d’onda POLICROMATICA: costituita da radiazioni di frequenza e lunghezza d’onda diverse

Le molecole interagiscono con una radiazione elettromagnetica ASSORBENDO o CEDENDO energia, passando da stadi ad energia minore a quelli ad energia maggiore (assorbimento) o da stadi ad energia maggiore a quelli ad energia minore (emissione)

Informazioni qualitative Informazioni quantitative Dall’energia assorbita od emessa sotto forma di radiazione si possono ricavare informazioni strutturale e/o analitiche Informazioni qualitative Natura della sostanza in esame Informazioni quantitative Quantità della sostanza in esame

Lo strumento utilizzato per misurare l’assorbimento è lo Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente a seconda della concentrazione Lo strumento utilizzato per misurare l’assorbimento è lo spettofotometro

Spettrofotometro UV-visibile Struttura:

Sorgenti Deve emettere radiazioni policromatiche, contenenti cioè tutte le lunghezze d’onde del campo richiesto Per la regione del visibile si utilizzano lampade ad incadescenza Per la regione UV si utilizzano lampade a scarica di gas

2. monocromatori Ne esistono due tipi: Basati su filtri (ottici o interferenziali) che bloccano una parte della luce e lasciano passare solo la parte desiderata Basati su un Elemento disperdente( prisma o reticolo) Che fanno incidere il fascio policromatico sull’elemento disperdente in grado di deviare le diverse radiazioni con i diversi angoli:la radiazione uscente sarà quella che passa attraverso la fenditura di uscita Il prisma è in grado di disperdere le radiazioni con diversa lunghezza d’onda grazie al fenomeno della rifrazione. I reticoli svolgono la stessa funzione del prisma ma il loro funzionamento è basato sull’interferenza

- Quarzo 3. Celle - Vetro Quarzo Alcuni materiali plastici Trasparente alla radiazione impiegata Preciso cammino ottico 3. Celle Visibile UV - Vetro Quarzo Alcuni materiali plastici - Quarzo

5. Elaborazione e presentazione dati 4. Rivelatori Dispositivi capaci di produrre un segnale elettrico che dipende dall’energia delle radiazioni che lo investono. 5. Elaborazione e presentazione dati Il segnale proveniente dal rivelatore viene Amplificato e trasmesso a Indicatore Eventuale registratore su carta Eventuale sistema computerizzato di elaborazione dati

Tipi di spettrofotometro: 1. Mono raggio ( preferibile per applicazioni quantitative) 2. A doppio raggio (preferibile per applicazioni qualitative)

Funzionamento dello spettrofotometro I rivelatori sono in grado di misurare l’intensità di flusso luminoso; In particolare vengono misurate: I0 : intensità del flusso luminoso all’ingresso della cella. I : intensità del flusso luminoso all’uscita della cella.

Trasmittanza T= I/Io 2. Assorbanza A= -log T Dalla misura dei flussi I0 e I gli strumenti forniscono direttamente i valori di : Trasmittanza T= I/Io 2. Assorbanza A= -log T Utilizzata nelle analisi quantitative poiché risulta direttamente proporzionale alla concentrazione A= εxbxC

Determinazione della concentrazione della sostanza in esame Metodo diretto Metodo indiretto

A= εxbxC 1°: Metodo diretto Legge dell’assorbimento (legge di Lambert-Beer) Prendendo in considerazione una cella, contenente una sostanza in soluzione, attraversata da un raggio di luce monocromatica, si dimostra che: A= εxbxC

A= εxlxC l = cammino ottico C = concentrazione ε = coefficiente di assorbimento molare o coefficiente di estinzione molare rappresenta l'assorbanza di una soluzione a concentrazione molare unitaria ad una data lunghezza d'onda, attraverso una cella di lunghezza ottica unitaria. Da notare che indica il valore di assorbanza del composto in esame quando l=1 cm e C = 1 e il suo valore dipende : - Lunghezza d’onda - Dalla natura del solvente - Dal PH - Dalla specie chimica che assorbe Da notare che il coefficiente di estinzione molare ε indica il valore di assorbanza del composto in Da notare che il coefficiente di estinzione molare ε indica il valore di assorbanza del composto in Da notare che il coefficiente di estinzione molare ε indica il valore di assorbanza del composto in Da notare che il coefficiente di estinzione molare ε indica il valore di assorbanza del composto in Da notare che il coefficiente di estinzione molare ε indica il valore di assorbanza del composto in esame quando [d = 1] cm e [ c = 1 ], e il suo valore dipende: esame quando [d = 1] cm e [ c = 1 ], e il suo valore dipende: esame quando [d = 1] cm e [ c = 1 ], e il suo valore dipende: esame quando [d = 1] cm e [ c = 1 ], e il suo valore dipende: esame quando [d = 1] cm e [ c = 1 ], e il suo valore dipende: ♦ dalla lunghezza d’onda della radiazione assorbita ♦ dalla lunghezza d’onda della radiazione assorbita ♦ dalla lunghezza d’onda della radiazione assorbita ♦ dalla lunghezza d’onda della radiazione assorbita ♦ dalla lunghezza d’onda della radiazione assorbita ♦ dalla natura del solvente ♦ dalla natura del solvente ♦ dalla natura del solvente ♦ dalla natura del solvente ♦ dalla natura del solvente ♦ dal pH ♦ dal pH ♦ dal pH ♦ dal pH ♦ dal pH ♦ dalla specie chimica che assorbe ♦ dalla specie chimica che assorbe ♦ dalla specie chimica che assorbe ♦ dalla specie chimica che assorbe ♦ dalla specie chimica che assorbe È invece indipendente dalla temperatura È invece indipendente dalla temperatura È invece indipendente dalla temperatura È invece indipendente dalla temperatura È invece indipendente dalla temperatura

ε% = assorbimento di una soluzione ad una determinata % ε = coefficiente di assorbimento molare o coefficiente di estinzione molare può essere: 1. NOTO 2. NON NOTO ε% = assorbimento di una soluzione ad una determinata %

Calcolando l’assorbanza con lo spettrofotometro e , applicando la formula inversa della legge di Lambert-Beer, si calcola la CONCENTRAZIONE della soluzione in esame C=A/ (εxb) A= εxbxC

L’equazione A = εbC rappresenta una retta passante per l’origine degli assi e in cui εxb è il coefficiente angolare

scarsa attendibilità del dato analitico Le condizioni di lavoro usuali prevedono che le soluzioni siano sempre diluite al massimo, compatibilmente con la sensibilità dello strumento, per avere valori accettabili di assorbanza Al crescere della concentrazione del soluto si verificano deviazioni notevoli con conseguente scarsa attendibilità del dato analitico ASSORBIMENTO CONCENTRAZIONE

Gli aminoacidi aromatici fenilalanina, tirosina e triptofano presentano assorbimenti intorno ai 280 nm attribuibili ai cromofori degli anelli aromatici . SPETTRI DELLE PROTEINE

SPETTRI DEGLI ACIDI NUCLEICI Le basi puriniche, adenina e guanina e quelle pirimidiniche, citosina e timina, hanno spettri simili con un picco a circa 260 nm.

2°: Metodo indiretto Colorimetria

La colorimetria è in biochimica tra le applicazioni più importanti dello spettrofotometro. Viene utilizzata per la determinazione quantitativa delle proteine.

Premesse… Proteina + Colorante Numerose sostanze possono reagire quantitativamente con un'altra sostanza a formare un complesso colorato detto comoforo. Proteina + Colorante COMPLESSO COLORATO L’ assorbimento è proporzionale alla quantità di colorante legato

Determinazione della concentrazione della sostanza in esame Metodo di Bradford Metodo del Biureto Determinazione della concentrazione della sostanza in esame Metodo di Lowry Metodo BCA

Metodo di Bradford Colorante utilizzato: Comassie Brillant blue

da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)

Procedimento per la determinazione della concentrazione (metodo della retta di taratura) preparare una soluzione proteica a concentrazione nota. Le proteine più usate nel metodo di Bredford sono: BSA (albumina di siero bovino) gamma-globuline

dalla soluzione preparata prelevare soluzioni di diversi ml, a concentrazioni note e crescenti. 1 2 3 4 5 X mg/ml 1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 16 mg/ml

ad ogni soluzione aggiungere acqua e reattivo (500 μl del reagente colorante di Bradford) Agitare ed attendere 5 min

misurare l’assorbanza.

riportare i valori di C noti e A ottenuta su un grafico cartesiano. unire i diversi punti ottenuti otteniamo la RETTA DI TARATURA 0.75 0.50 Intensità del colore blu Assorbanza a 595 nm 0.35 0.18 0.1 1 2 4 8 16 mgL-1 di proteina

Per interpolazione otteniamo il valore di Cx Prendo il campione di cui voglio calcolare la concentrazione, aggiungo acqua e reattivo, ne misuro l’assorbimento. riportiamo il valore dell’ Ax ottenuto, sul grafico Ax Per interpolazione otteniamo il valore di Cx 0.50 Intensità del colore blu Assorbanza a 595 nm 0.35 0.18 0.1 1 2 4 8 16 mgL-1 di proteina

Colorante utilizzato: reattivo del Biureto Metodo del Biureto Colorante utilizzato: reattivo del Biureto soluzione di solfato di rame alcalino contenente potassio tartrato di sodio Cu2+

–NH presenti in altrettanti In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+ formano un complesso di coordinazione con quattro gruppi –NH presenti in altrettanti legami peptidici Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a 550 nm

Colorante utilizzato: Reattivo di Folin Metodo del Lowry Colorante utilizzato: Reattivo di Folin Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile, con un picco a 750nm Molto sensibile: è possibile determinare concentrazioni fino a 10 µg/ml

Reattivo utilizzato: Riduzione del Cu+2 a Cu+1 in soluzione alcalina Metodo BCA acido bicinconinico Reattivo utilizzato: Riduzione del Cu+2 a Cu+1 in soluzione alcalina

Due molecole di BCA chelano uno ione rameoso (Cu+1) Tale evento determina la formazione di un intenso colore violetto con un massimo di assorbimento a 562 nm