1 STUDIO DELL’INTERAZIONE TRA FUSARIUM GRAMINEARUM E TRITICUM AESTIVUM E SVILUPPO DI METODI DIAGNOSTICI PER IL RILEVAMENTO DI FUSARIOTOSSINE Dott. Chiara Nobili

2 Le contaminazioni fungine rappresentano una delle principali problematiche in campo alimentare MICOTOSSINE () Fusarium graminearum produttore di varie micotossine tra cui i tricoteceni (DON)

3 Deossinivalenolo (DON)

4 Nell’uomo e negli animali i danni maggiori si hanno nel tratto digerente. Per questo sono stati fissati dei limiti di legge consentiti (e.g ppm in cereali) a seconda del tipo di matrice (CE 856/2005 e CE 1881/2006). DON Il DON è tossico per: - l’uomo e gli animali - la pianta ospite Nelle piante è un fattore di virulenza che inibisce la sintesi di proteine di difesa provocando clorosi, apoptosi e appassimento della spiga (fusariosi della spiga-FHB). SVILUPPARE STRATEGIE DI PREVENZIONE E DI CONTROLLO

5 Interazione F. graminearum e Triticum aestivum La modulazione dei fenomeni associati allo stress ossidativo sono fondamentali nel determinare le sorti dell’interazione Gli effetti del DON in grano tenero contaminato da F. graminearum, agente eziologico della fusariosi della spiga (FHB): la produzione di perossido d’idrogeno (Desmond et al., 2008) I meccanismi di difesa attuati dal grano in presenza di DON, come ad esempio il “mascheramento delle micotossine” (Berthiller et al., 2007)

6 Monitoraggio della crescita fungina su diverse varietà di grano tenero Analisi dell’attività di alcuni enzimi coinvolti nel meccanismo di difesa della pianta Analisi dell’espressione di geni del fungo e del grano coinvolti nell’interazione Quantificazione del DON e alcuni dei suoi derivati

7 Ceppo Fg126 Ceppo Fg8308 Relazione tra profilo tossigenico e reale capacità patogenica SAGITTARIO (suscettibile al FHB) BLASCO (tollerante al FHB) Relazione tra tolleranza / suscettibilità e capacità di reazione all’azione patogena del fungo Fusarium graminearum Triticum aestivum

8 Identificazione dei ceppi di Fusarium graminearum mediante PCR end-point con primer specifici per ceppi alti (N1-2) e bassi (tri5-6) produttori di DON M Fg126 Fg8308 N1-2 tri5-6 N1-2 tri5-6 Frammenti specifici ottenuti soltanto amplificando il DNA dei due isolati fungini con primer specifici per alti produttori di DON

9 Quantificazione del DNA di fungo La diversa crescita del ceppo Fg126 rispetto al ceppo Fg8308 maggiore sulla varietà suscettibile (SAGITTARIO), è confermata anche dall’analisi della varianza (test di Fisher)

10 Perché? Analisi in pianta di alcuni fattori legati alla difesa quali: produzione di ROS nell’ambiente di interazione produzione di lipoperossidi nel grano capacità di detossificarsi dal DON Maggiore crescita del ceppo Fg126 rispetto al ceppo Fg8308 in particolare sulla varietà suscettibile (SAGITTARIO) Analisi in fungo di alcuni geni legati a: protezione dallo stress ossidativo capacità di penetrazione nella pianta ospite biosintesi dei tricoteceni

11 Studio della produzione di ROS e dell’attività di alcuni enzimi antiossidanti nel grano In termini assoluti l’attivazione enzimatica antiossidante è maggiore nella varietà tollerante infettata con il ceppo Fg8308 il grano utilizza i ROS per arginare l’infezione (notevole aumento di ROS nella varietà suscettibile contaminata con Fg8308) il sistema più resistente è la varietà tollerante contaminata con Fg8308

12 Studio dell’attività dell’enzima lipossigenasi (LOX) e produzione di lipoperossidi (9 e 13-HPODE) nel grano Il sistema reagisce alla patogenicità del fungo producendo precursori di composti antimicrobici (9-HPODE) soprattutto nella varietà suscettibile contaminata con Fg8308

13 Espressione dei geni gt e PR1 del grano Attivazione maggiore a tempi lunghi, in presenza di elevate quantità di micotossina Espressione di tali geni maggiore in presenza di una significativa crescita del patogeno. Si può notare una reazione precoce nella varietà tollerante e una down-regolazione in quella suscettibile probabilmente indotta dalla virulenza del patogeno.

14 Espressione del gene Fgyap1 del fungo Espresso soprattutto nelle varietà infettate con Fg8308 Il ceppo Fg8308 attiva le proprie difese antiossidanti per crescere sulla varietà suscettibile, più del ceppo Fg126

15 Espressione dei geni ftl1 e ePG del fungo Maggiori livelli di espressione nella varietà suscettibile contaminata con il ceppo Fg126 Maggiore virulenza e capacità di penetrazione nella pianta del ceppo Fg126

16 Espressione del gene tri6 del fungo Sovraespresso nella varietà SAGITTARIO (S) A 168 ore è sottoespresso solo nella varietà BLASCO (T) infettata con Fg8308 Concentrazione di DON per tempi lunghi di infezione: alta nella varietà suscettibile contaminata con Fg8308 bassa nella varietà tollerante contaminata con Fg8308

17 Quantificazione di DON tramite HPLC Il ceppo Fg8308 produce meno DON nella varietà tollerante, mentre una virulenza più accentuata è riscontrata sulla varietà suscettibile.

18 Quantificazione di 3-acetil DON e 15-acetil DON tramite HPLC Il ceppo Fg8308 è il solo produttore di 15-ADON Solo il ceppo Fg126 riesce a mettere in atto una strategia auto- difensiva acetilando in posizione 3 il DON

19 Quantificazione di 3-glucosil DON tramite HPLC Indipendentemente dalle caratteristiche intrinseche dell’isolato fungino e della pianta infettata, quest’ultima converte parte (5-10%) del DON prodotto dal patogeno nella forma glucosilata (3-GDON)

20 Conclusioni I metodi diagnostici sviluppati hanno consentito di mettere in evidenza una differenza nella velocità di accrescimento del F. graminearum e di sintesi di DON direttamente nelle cariossidi delle varietà di grano tenero usate La tolleranza del grano tenero nei confronti di F. graminearum sembra essere legata alla capacità della pianta di indurre una risposta difensiva precoce nell’ambiente di interazione La tolleranza del grano tenero nei confronti della fusariosi si esplica soprattutto grazie alla capacità di inibire la sintesi di DON e di convertirlo in forme meno tossiche

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