Ottimizzazione dei terreni di coltura Metodi statistici

Metodiche innovative per la ottimizzazione della formulazione dei terreni di coltura industriali In un processo fermentativo è frequente osservare interazioni combinatoriali tra componenti del mezzo, metabolismo cellulare e produzione del composto in oggetto!! L’approccio empirico alla ottimizzazione della formulazione (full factorial search) non è il migliore perché non può “prevedere” l’interazione/ interferenza tra singoli componenti! Metodi statistici alla ottimizzazione della composizione dei terreni di coltura Fractional factorial search Responce surface methodology

Full factorial search Prove in cui una variabile indipendente (concentrazione di nutriente, pH, temperatura ecc..) viene fatta variare mentre si lasciano costanti gli altri parametri, quindi la procedura va ripetuta per tutte le variabili Numero di prove= x n x è il numero di livelli (valore che si vuole valutare per ogni variabile) n è il numero dei variabili da considerare

Full factorial search Numero di prove= x n Tre nutrienti a due concentrazioni: 2 3= 8 prove Sei nutrienti a tre concentrazioni : 3 6 =729 prove !!!!!!!!! esponenziale!!!!!!! Il numero di combinazioni aumenta all’aumentare delle variabili in maniera esponenziale!!!!!!!

Fractional Factorial design: Il metodo statistico di Plackett-Burman In questo metodo:  É possibile studiare l’effetto principale (lineare) di ogni variabile con un numero limitato di prove (una frazione di quelle possibili)  Si assume che le variabili non agiscano sinergicamente tra di loro  Si utilizza una matrice con precise caratteristiche (la matrice di Hadamard) per descrivere il numero minimo di esperimenti da effettuare

X = Fractional Factorial design: Il metodo statistico di Plackett-Burman La matrice di Hadamard è una matrice di 1 e -1 in cui le colonne sono ortogonali Il principio con il quale è costruita la matrice e è quello di effettuare delle prove che descrivano al meglio l’intero spazio delle possibili prove, ovvero gli esperimenti sono scelti in modo da stimare, tra le possibili condizioni, quelle più distanti.

Fractional Factorial design: Il metodo statistico di Plackett-Burman Nella matrice degli esperimenti sulle colonne sono indicate le variabili da valutare e sulle righe gli esperimenti da effettuare, i valori che assumono le variabili sono solitamente due e indicano due possibili concentrazioni del componente

solo nel caso in cui non ci siano interazioni fra le variabili generatori di matrici Il metodo di Plackett-Burman consente di studiare l’effetto principale di ogni variabile con un ridotto numero di esperimenti solo nel caso in cui non ci siano interazioni fra le variabili, poiché nella realtà molto spesso ci sono effetti sinergici fra i componenti di un mezzo di coltura sono stati sviluppati dei generatori di matrici che consentono di costruire matrici, e quindi pianificare esperimenti, che tengano conto anche di questo effetto. Fractional Factorial design

scelta la matrice Una volta scelta la matrice più adatta si effettuano gli esperimenti indicati dalle righe della matrice registrano i valorisi registrano i valori della quantità da ottimizzare ottenuti per ogni esperimento valutare l’effettobisogna valutare l’effetto di ogni singolo componente sul risultato. “significativi”un’interpolazione Per avere idea di quali composti sono “significativi” si fa un’interpolazione, lineare e/o quadratica, dei valori della quantità da ottimizzare ottenuti Fractional Factorial design: interpretazione dei risultati

Interpretazione dei risultati i valori di tali coefficientil’informazione sull’influenza componenti sono critiche Le funzioni scelte per l’interpolazione (tecnica di regressione multipla, lineare o quadratica) sono funzioni parametriche che hanno come parametri i coefficienti di peso delle variabili; dall’interpolazione si ottengono i valori di tali coefficienti che forniscono l’informazione sull’influenza delle diverse variabili sul risultato, consentendo di stabilire quali componenti sono critiche nella formulazione del terreno. Y=b 0  b i x i  b ii x i 2  b ij x i x j

concentrazione ottimale Una volta individuati i componenti “critici” grazie al fractional factorial design in molti lavori recenti si fa seguire la determinazione della concentrazione ottimale di ogni componente chiave individuato. Responce Surface Methodology (RSM). prevedere Questa ottimizzazione si può ottenere usando un'altra tecnica chiamata Responce Surface Methodology (RSM). Questo metodo statistico, dopo aver progettato una nuova serie di esperimenti (design)e aver ottenuto i rispettivi risultati, permette di costruire un modello dal quale è possibile prevedere in che condizioni si ottiene il risultato migliore Responce Surface Methodology (RSM)

modello carta topografica Semplificando al caso di due sole variabili è possibile descrivere il modello ottenuto con la tecnica RSM come una carta topografica in cui le superfici racchiuse da una curva invece di indicare punti alla stessa altitudine indicano i casi in cui, al variare delle due variabili in esame, si ottiene lo stesso valore del parametro da ottimizzare (biomassa, produzione di un metabolita ecc..).

Responce Surface Methodology (RSM) La tecnica può essere applicata a diversi livelli di sofisticazione, nel caso più semplice per delineare la ”superficie di risposta” migliore si parte dallo spazio descritto delle due variabili da analizzare, in questo spazio si fanno n esperimenti e ottenuti i risultati si restringe lo spazio alla zone che contiene l’esperimento (il punto) con il risultato migliore, quindi si ripete l’operazione nel nuovo spazio finché la differenza fra il risultato migliore del ciclo precedente e quello ottenuto con il ciclo in corso è trascurabile.

Responce Surface Methodology (RSM) sofisticate modelli matematici Applicazioni più sofisticate della tecnica RSM usano modelli matematici per: analizzare analizzare i dati sperimentali costruire costruire il modello prevedere prevedere le relazioni tra il risultato e i valori assunti dalle variabili.

Metodi statistici: un esempio Questo insieme di tecniche statistiche 1.per la progettazione di esperimenti 2.la costruzione dei modelli 3.la valutazione degli effetti dei vari fattori 4.la ricerca delle condizioni ottimali ha consentito l’ottenimento della formulazione migliore in moltissimi casi, anche nel caso di fermentazioni finalizzate a prodotti completamente diversi come proteine ricombinanti antibiotici o biomassa.