ASSORBIMENTO E EMISSIONE Atomi o molecole, trovandosi in campi energetici possono assorbire quantità definite e caratteristiche di energia Se atomi o molecole vengono eccitati da adatte radiazioni elettromagnetiche, gli e passano dallo stato fondamentale a quello eccitato assorbendo un energia, si ha il fenomeno di ASSORBIMENTO Se, quando dagli stati eccitati ritornano allo stato fondamentale, gli atomi o le molecole emettono energia sotto forma di radiazioni elettromagnetiche si ha il fenomeno di EMISSIONE (FLUORESCENZA, ns O FOSFORESCENZA, ms) L'analisi spettrofotometrica consiste nella misurazione di radiazioni elettromagnetiche per ottenere informazioni sia qualitative che quantitative: ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d'onda ben determinata – l'analisi dello spettro permette di individuare la natura della sostanza in esame – la misura dell'intensità delle radiazioni emesse o assorbite permette di stabilirne la quantità

In genere per l’assorbimento nell’UV e nel Visibile (λ=200–700 nm) sono interessati, nelle transizioni energetiche, gli elettroni esterni della molecola sia quelli impegnati in un legame sia quelli non impegnati I cromofori sono porzioni di molecole che hanno la capacità di interagire con la luce. Esistono diversi tipi di cromofori: i legami peptidici, le basi azotate e gli amminoacidi aromatici.

Assorbanza (A)= log1/T= log(I0 / I1) Cuvetta contenente il campione Spettrofotometro l I0 I1 Rivelatore Sorgente I0 Quando si fa passare una luce di una particolare lunghezza d’onda λ attraverso un percorso l di una soluzione di concentrazione definita, una certa porzione della luce è assorbita dalla soluzione Se l’energia della luce incidente è I0 e l’energia della luce trasmessa (dopo essere passata attraverso la soluzione) è I1, allora la frazione di luce trasmessa è I1/I0, nota come trasmittanza T Se T = 100%, la sostanza è trasparente Se T = 0%, la sostanza è opaca ed assorbe completamente la luce Assorbanza (A)= log1/T= log(I0 / I1) L’assorbanza è adimensionale

Assorbanza a 280 nm “innocuo” sul campione La concentrazione delle proteine può essere stimata misurandone l’assorbanza a 280 nm (UV) per la presenza degli amminoacidi aromatici triptofano (W), tirosina (Y) e fenilalanina (F) Poiché la composizione in amminoacidi delle proteine varia notevolmente, l’assorbimento molare varierà anch’esso di molto, a seconda del contenuto di questi amminoacidi Proteine che non contengono W, Y e F non avranno un massimo di assorbimento a 280 nm, mentre proteine che contengono molti residui di W, Y e F avranno elevati valori di assorbimento molare, con un massimo di assorbimento a 280 nm Il metodo non è quindi molto accurato a meno che la proteina sia pura e ne sia noto il coefficiente di estinzione

VANTAGGI DEL METODO Non è distruttivo Consente misure in continuo, ad esempio su un eluato di una colonna cromatografica Il limite di sensibilità può essere aumentato in maniera significativa misurando i massimi di assorbimento a lunghezza d’onda comprese tra 190 e 220 nm

SVANTAGGI Necessità di utilizzare cuvette di quarzo…. Presenza di altri composti che assorbono a 280 nm gli anelli purinici e pirimidinici degli acidi nucleici hanno massimi di assorbimento vicini a 260 nm, con un assorbimento considerevole che si estende fino a 280 nm Se gli acidi nucleici sono gli unici contaminanti, la concentrazione della proteina può essere stimata adoperando una formula che corregge bene per il contenuto in acidi nucleici: [proteina] (mg/ml) = 1,55 A280 – 0,76 A260

Analisi qualitativa: spettro di assorbimento Curva ottenuta congiungendo i valori di assorbimento in funzione della lunghezza d’onda Ogni sostanza assorbente ha un suo caratteristico spettro utile alla identificazione di tale sostanza nel campione in esame (presenza di picchi di assorbimento caratteristici ) NADH ha due picchi, 260 e 340 nm NAD+ ha un solo picco, 260 nm

Spettro di assorbimento UV-VIS di un RNA DNA: 1 O.D.= 50 µg/ml RNA: 1 O.D.= 40 µg/ml

Spettro di assorbimento UV-VIS di una proteina Picco di assorbimento di Tirosine e Triptofani Assorbimento 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 Lunghezza d’onda “l” (nm)

Coefficiente di estinzione LEGGE DI LAMBERT-BEER Assorbanza (A)= log(I0 / I1)= εcl L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di proteina (C) e alla lunghezza della cuvetta (l) Coefficiente di estinzione ε è il coefficiente di estinzione molare [concentrazione in molarità (M) e percorso della luce in centimetri (cm)] ε è il coefficiente di estinzione percentuale (concentrazione 1mg/ml e percorso della luce in cm)

L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione del campione: mettendo in grafico l’A in funzione di c avremo una retta passante per l’origine degli assi Se l= 1 cm la pendenza della retta data da A/c = e fornisce il valore del coefficiente di estinzione molare alla l considerata A c e Secondo la legge di Lambert–Beer, più elevata è la concentrazione delle molecole che passano dallo stato fondamentale a quello eccitato, maggiore sarà l’assorbanza

APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA analisi qualitativa: spettro d’assorbimento analisi quantitativa diretta: le sostanze hanno un massimo di assorbanza ad una data lunghezza d’onda (per le proteine 280 nm) analisi quantitativa indiretta: reazione colorimetrica; molte sostanze possono reagire con altre a dare un prodotto colorato Attività enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di una sostanza con un picco caratteristico di assorbimento che partecipi come substrato o come prodotto alla reazione enzimatica in esame

Per studiare una PROTEINA è necessario averla in Purificazione di proteine Per studiare una PROTEINA è necessario averla in FORMA PURA (OMOGENEA) la proteina di interesse deve essere l’unica presente nel campione a disposizione La purificazione è una delle procedure più comuni della biochimica pratica e costituisce il primo passaggio essenziale nell’analisi delle proprietà fisiche e biologiche di una proteina

Nei campioni biologici (tessuti, cellule, ecc.) le proteine sono sempre presenti in miscele complesse che possono contenere migliaia di proteine diverse La proteina di interesse deve essere purificata da una fonte opportuna (cioè da un campione biologico che la contenga in concentrazione sufficiente) Maggiore è la concentrazione della proteina di interesse nella fonte scelta più semplice è la purificazione

Scelta della fonte

Quasi tutte le informazioni necessarie sono disponibili: RICERCA BIBLIOGRAFICA Quasi tutte le informazioni necessarie sono disponibili: Bibliografia: http://www.pubmed.org Struttura proteine: http://www.rcsb.org

GRADO DI PUREZZA Piccole quantità di contaminanti possono essere tollerate (a seconda dell’impiego che si intende fare della proteina) ad esempio gradi di purezza del 95% - 98% sono sufficienti per la maggior parte degli studi alcuni tipi di studio come la determinazione della struttura mediante cristallografia richiedono campioni proteici particolarmente puri

INVESTIGATORI DELLA CIA OBIETTIVO: catturare un terrorista I FASE: INDAGINI DOMANDE: Quali informazioni abbiamo? Come si chiama e che aspetto ha? Di cosa si occupa? Quali ambienti frequenta? Ha guardie del corpo o sosia? II FASE: preparazione del piano di cattura Lo vogliamo vivo o morto? Analisi del territorio Quanti uomini sono necessari? FASE OPERATIVA Circondare la zona e costringerlo ad uscire Isolamento dal gruppo (escludere i sosia) Arresto ed interrogatorio BIOCHIMICI OBIETTIVO: purificare una proteina I FASE: RICERCA BIBLIOGRAFICA DOMANDE: Quali informazioni abbiamo? Quali sono le caratteristiche della proteina? Quali funzioni svolge nella cellula? Dove è presente in elevate quantità? Quali difficoltà ci aspettiamo di incontrare? II FASE: scelta della procedura Qualità o quantità? Identificazione della fonte Scelta dei passaggi FASE OPERATIVA Preparazione del campione di partenza Isolamento e purificazione Caratterizzazione

Ogni passaggio di purificazione separa le proteine in diverse frazioni (frazionamento) Su ciascuna frazione viene determinata la quantità di proteine totali e le U di proteina di interesse Una U di enzima (E) è definita come la quantità di E necessario per convertire 1 µmol di S in P in 1 min (a T e pH ottimale)

Durante una purificazione ottimale la resa diminuisce mg o U di proteina di interesse nella frazione mg o U di prot. di interesse all’inizio della purificazione Resa= mg di proteina di interesse nella frazione mg di proteine totali presenti nella frazione Purezza = Il grado di purezza di un enzima in una particolare frazione è espresso tramite l’Attività specifica, la quale pone in relazione l’attività enzimatica totale con il contenuto totale di proteine presenti nella preparazione U di proteina di interesse nella frazione mg di proteine totali presenti nella frazione Attività specifica = Durante una purificazione ottimale la resa diminuisce e l’As aumenta

La prima fase di una purificazione è l’omogenizzazione del campione Ogni passaggio di purificazione separa le proteine in diverse frazioni (frazionamento) La prima fase di una purificazione è l’omogenizzazione del campione (serve a liberare la proteina dalle cellule e dai tessuti) Sonicazione (ultrasuoni) Presse Omogenizzatori Meccanici Proteasi, detergenti

Il metodo è adatto per tessuti animali e vegetali, ma non per microrganismi perché questi non sono disgregati dal trattamento

omogenizzatori Sistemi meccanici 1.Prodotto non omogenizzato Omogenizzatori a pestello: -Il tessuto viene messo in una provetta di vetro all'interno del quale agisce un pestello di vetro o di metallo -Il tessuto è forzato a passare tra le pareti della provetta, che viene mantenuta ferma, e il pistone mobile che ruota.. -Le forze frizionali che si svilupperanno dipenderanno anche dalla velocità di rotazione del pestello..

Microscopia a contrasto di fase             prima (1) durante (2) dopo (3) Cellule di lievito visualizzate tramite microscopia a contrasto di fase:

Congelamento-scongelamento SISTEMI MECCANICI French press E’ l’apparecchio più usato per la rottura dei microrganismi Le cellule scoppiano per l’alta pressione (108 Pa) Congelamento-scongelamento le cellule si rompono a causa delle differenze di temperatura Sonicatore ultrasuoni (10.000-15.000 Hz) Le pareti cellulari si rompono a causa delle elevate ondate pressorie

ULTRASUONI PER LISARE MICROORGANISMI Le cellule sono introdotte in una camera dove vengono generate onde sonore ad alta frequenza (>20 kHz) per tempi variabili (30-60’’) Le onde sonore generano ondate pressorie che rompono le cellule tramite forze cavitazionali. Le bolle di gas presenti nel mezzo inizialmente sono sotto pressione ma quando si rompono vengono prodotte onde d’urto che causano la rottura cellulare LA SONICAZIONE DETERMINA UN ELEVATO AUMENTO DI CALORE, PER CUI TUTTE LE OPERAZIONI VANNO ESEGUITE IN GHIACCIO

La lisi cellulare va effettuata in un tampone di lisi…. PERCHE’? I processi biologici richiedono un pH ottimale Il pH ottimale per un dato enzima sarà il pH del compartimento cellulare in cui l’enzima lavora : Es. citoplasma pH=neutro, Lisosomi pH=5, succhi gastrici pH=1 Gli studi in vitro dei processi metabolici devono quindi considerare il pH ottimale del processo enzimatico o cellulare da studiare

COSA CONTENGONO I TAMPONI DI LISI? Soluzioni tampone comunemente usate Tris-HCl, K-fosfato con forze ioniche tra 0.1 e 0.3 M e un pH tra 7 e 8 Antiossidanti (riducenti): DTT, beta-mercaptoetanolo, cisteina o glutatione La cellula ha un ambiente riducente ma dopo rottura le proteine si trovano esposte ad un ambiente ossidante SH- HS ossidazione S- S Agenti chelanti ioni divalenti: EDTA, EGTA

Inibitori di serin proteasi: PMSF (fenilmetil sulfonilfluoro) Inibitori degli enzimi Inibitori di serin proteasi: PMSF (fenilmetil sulfonilfluoro) DFP (di-isopropilfosfofluoruro) TPCK (Tosilfenilalanil-clorometilchetone) 2) Inibitori di tiolo proteasi: iodoacetato; cistatina 3) Inibitore dell’ aspartico proteasi : pepstatina 4) Inibitori delle metalloproteasi: EDTA ; 1,10-fenantrolina 5) Inibitori della esopeptidasi: Amastatina; Bestatina

Non ionici: Triton X-100, NP-40 Ionici: SDS, sodio deossicolato, CHAPS