Operazioni a valle Downstream processing Operazioni a monte Upstream processing SCELTA DEL CEPPO MIGLIORAMENTO DEL CEPPO

È il processo diretto alla distruzione di tutte le forme di vita microbica presenti in un brodo, in un ambiente, su una superficie La contaminazione di un brodo di fermentazione può determinare: -diminuzione della produttività -contaminazione del prodotto finale -degradazione del prodotto Sterilizzazione

Durante una fermentazione industriale, la contaminazione può essere evitata: -con l’uso di un inoculo puro -sterilizzando il mezzo di coltura e le apparecchiature ausiliarie -sterilizzando il fermentatore -sterilizzando tutto ciò che viene aggiunto durante la produzione (soluzioni acido/base, antischiuma, aria) -operando in condizioni sterili durante il processo Alcune fermentazioni sono definite “protette” e quindi non necessitano di una vera e propria sterilizzazione in quanto la composizione del brodo di partenza e le condizioni che si determinano nel corso della fermentazione non facilitano la crescita di altri microrganismi al di fuori di quello che opera la trasformazione (es. produzione della birra, il mosto viene bollito ma non sterilizzato).

Sterilizzazione mediante AGENTI FISICI mediante AGENTI CHIMICI AGENTI FISICI : calore umido (autoclave) calore secco incenerimento radiazioni (U.V., raggi X, raggi gamma) filtrazione AGENTI CHIMICI: fenoli, alcoli acidi/basi aldeidi agenti ossidanti (Cl 2 e derivati)

La “morte termica” di una popolazione microbica può essere considerata come una reazione chimica che segue una cinetica del primo ordine: Cinetica di morte di una popolazione microbica k = tasso di mortalità, costante specifica di morte termica La “morte “ o inattivazione termica di endospore e cellule vegetative comporta : -la denaturazione delle proteine -la disorganizzazione delle membrane cellulari -il danno al DNA N = numero cellule vitali

Indicando con: - N 0 il numero dei microrganismi al tempo t 0 = 0 - N t il numero di sopravvissuti al tempo t integrando l’eq. precedente, nell’intervallo t-t 0, in cui N 0 diventa N t, e ponendo t 0 =0 si ha : Cinetica di morte di una popolazione microbica ovvero :

La relazione non permette il calcolo del tempo necessario alla sterilizzazione completa del campione, poiché un tempo “infinito” sarebbe necessario per ridurre a 0 il numero di cellule vitali. Però: se N t <1 alla fine del trattamento termico il campione si può considerare praticamente sterile. Pertanto: Esempio: se N t = 0,1 alla fine del trattamento significa che la conta delle cellule vitali ci dà 0,1 cellule cioè 1 cellula su 10 batch esaminati. Obiettivo pratico della sterilizzazione, deve essere quello di operare in modo tale che alla fine del trattamento, la probabilità che sia presente una sola cellula vitale sopravvissuta sia estremamente bassa.

K dipende dalla specie microbica e dal suo stato fisiologico

k dipende dalla temperatura A (min -1 ) è una costante che dipende dalla specie microbica E a (J mol -1 ) = energia di attivazione della reazione di morte termica di quella specie microbica R (8.31 J mol -1 K -1 ) = costante universale dei gas T ( °K) = temperatura ovvero:

Il tempo necessario per la sterilizzazione (ad una data temperatura) dipende da k e da N 0, cioè dalla grandezza della popolazione iniziale. Dalla relazione: Ponendo: Si ha: Il Del factor o “criterio di design per la sterilizzazione” è la misura del numero delle cellule vitali sopravvissuta ad un determinato trattamento termico in un certo tempo. E’ una misura del grado di sterilizzazione. N 0 può essere misurato (conta totale) N t deve essere fissato (k deve essere noto, alla temperatura prescelta per la sterilizzazione) Del factor

Del factor aumenta all’aumentare del volume del fermentatore Nel Del factor sono presi in considerazione: i) la grandezza iniziale della popolazione, cioè il numero dei contaminanti (N 0 ) ii) il numero dei sopravvissuti al trattamento termico (N t ) Se aumentano le dimensioni del fermentatore aumenta il numero di contaminanti e quindi anche il Del factor: -fermentatore da 1000 l contenente un terreno con 10 6 microrganismi/cm 3 -fermentatore da l contenente lo stesso tipo di terreno

Quale temperatura scegliere ? riarrangiando: intercetta: pendenza: considerando i logaritmi: Combinando le due relazioni: si ottiene: 1/T

Lo stesso Del factor, cioè lo stesso grado di sterilizzazione, per un data specie microbica, può essere raggiunto in un ampio intervallo di coppie di valori tempo/temperatura. A seconda del Del prefissato si può scegliere la coppia tempo/temperatura a cui operare la sterilizzazione.. L’equazione: permette il design della procedura di sterilizzazione. Conoscendo N 0, fissando N t (quindi calcolando Del factor) e conoscendo E a e A, si può scegliere la coppia temperatura tempo a cui operare.

Non potendo conoscere la cinetica di morte termica di tutti i contaminanti presenti in un terreno di fermentazione, si assume che gli unici contaminanti presenti siano spore di Bacillus stearotermophylus, in quanto questa specie rappresenta la specie microbica più termoresistente conosciuta. utilizzando, quindi, i valori di Ea e A delle spore di B. stearotermophylus utilizzato come microrganismo modello, è possibile inserire nei calcoli un fattore di sicurezza significativo. La specie microbica più termoresistente conosciuta: le spore di Bacillus stearotermophylus

Durante la sterilizzazione del terreno di coltura si possono verificare reazioni che ne diminuiscono il valore nutritivo: -interazione tra i componenti del brodo (es. reazioni del Maillard) -degradazione componenti termolabili (es. vitamine) -ossidazione dei lipidi La distruzione o inattivazione termica di un nutriente può essere considerata una reazione che segue una cinetica di 1° ordine, quindi: da cui: dove: C t : conc. del nutriente al tempo t C 0 : conc. del nutriente al tempo 0, inizio del trattamento k c è la costante di inattivazione termica del nutriente (min -1 ) Inattivazione termica dei nutrienti ovvero:

Reazione di Maillard

Reazione del Maillard : a temperature elevate, il glucosio reagisce con l’-NH 2 degli aa. dando luogo alla formazione di N-glicosilammina, a ciò si accompagna una diminuzione delle proprietà nutritive del terreno

Poiché k c dipende dalla temperatura: È la frazione di nutriente che non si è degradata, diminuisce all’aumentare del tempo e della temperatura di sterilizzazione. Si avrà:

Un aumento di temperatura ha un effetto maggiore sulla morte termica delle spore che sulla inattivazione termica del nutriente. Pertanto, è più vantaggioso operare ad alte temperature per tempi brevi. In questo modo si ottiene una degradazione minore dei nutrienti. La cinetica di inattivazione di un nutriente è meno dipendente dalla temperatura della cinetica di morte delle spore di B. stearothermophylus Fattori da tenere in considerazione per scegliere la coppia tempo-temperatura

Sterilizzazione batch (o discontinua) Poiché la temperatura varia nella fase di riscaldamento e di raffreddamento Il Del factor è dato dall’integrazione di questa equazione: E’ ottenuta per immissione di vapore fluente al fermentatore contenente il terreno oppure riscaldando le pareti del fermentatore.

Sterilizzazione in continuo (terreno) Il mezzo nutriente viene sterilizzato a parte, facendolo fluire in tubi riscaldati. Vengono ridotti drasticamente i tempi di riscaldamento e di raffreddamento per cui risulta migliore la qualità del terreno.

Sterilizzazione dell’ aria L’ aria fornita al fermentatore viene sterilizzata per filtrazione. L’aria contiene in media circa contaminanti m -3. La velocità di aerazione è, in genere, di circa 0,5-1,0 vvm. Pertanto: Un volume di 50 m 3 aerato a 1 vvm necessita di 50 m 3 aria min -1, cioè 3000 m 3 aria h -1