REPLICAZIONE DEL DNA

FUNZIONI DEL DNA Il DNA è la molecola che contiene l’informazione per la sintesi di tutte le proteine della cellula, sia quelle che costituiscono delle componenti strutturali, sia quelle che fungono da catalizzatori (enzimi) di reazioni chimiche che fanno parte del metabolismo cellulare.

E’ ESSENZIALE PERCIO’ CHE TALE INFORMAZIONE: sia mantenuta inalterata durante tutta la vita della cellula, riparando eventuali danni che potrebbe ricevere; sia espressa, ossia venga trascritta in RNA e tradotta in proteine, in modo regolato a seconda delle necessità dell’organismo; sia trasmessa, inalterata e completa, da ciascuna cellula alle cellule-figlie. Ciò si realizza attraverso un processo di duplicazione del DNA molto preciso e controllato, in cui ogni molecola di DNA funziona come stampo per la sintesi di una molecola identica;

La duplicazione del DNA è semi-conservativa, cioè ognuna delle catene del DNA originale (o parentale) fa da stampo per la sintesi di una catena complementare

by Meselson & Stahl (1957)

La replicazione del DNA I step: separazione dei filamenti complementari di DNA II step: aggiunta di nuovi nucleotidi sulla base di uno stampo (complementarietà delle basi)

Nell’uomo: circa 50 basi/sec La duplicazione del DNA inizia a partire da specifiche sequenze, le “origini” Nei batteri, il cui DNA è costituito da un’unica molecola di DNA circolare, l’origine della duplicazione è unica, e da essa la duplicazione avanza nelle due direzioni finché i due apparati di duplicazione non si incontrano, avendo così duplicato tutto il DNA Nei batteri: circa 1000 basi/sec Nell’uomo: circa 50 basi/sec

Nelle cellule eucariote, in cui il DNA è suddiviso in tante molecole lineari quanti sono i cromosomi, ed è molto più grande, affinché la duplicazione possa completarsi in tempi abbastanza brevi (alcune ore) è necessario che la duplicazione inizi contemporaneamente da più origini per ciascun cromosoma La duplicazione del DNA è bidirezionale, cioè da ogni origine si generano due forcelle di duplicazione che procedono in senso opposto Punto di origine della duplicazione Due molecole figlie di DNA Filamento originario Filamento di nuova sintesi Bolla di duplicazione

CHE COSA SERVE PER DUPLICARE IL DNA? lo stampo (ciascuna delle due catene del DNA) i monomeri (i desossiribonucleosidi-trifosfati) gli enzimi (DNA-polimerasi e molti altri) gli inneschi (o primers)

lo stampo, o meglio, la coppia di stampi, sono le due catene “parentali” che si separano; i monomeri, ossia i singoli nucleotidi: essi devono contenere l’energia necessaria per la formazione di ogni nuovo legame: tale energia si trova sottoforma di legami chimici. I monomeri per la sintesi del DNA sono desossiribonucleosidi-trifosfati: l’idrolisi di un legame P-P ad alta energia permette la formazione del legame fosfodiestereo fra ogni nuovo nucleotide e l’ultimo nucleotide della catena che si sta formando ;

gli enzimi: la sintesi delle nuove catene polinucleotidiche è svolta da enzimi noti come DNA-polimerasi essi catalizzano la reazione di formazione di un legame fosfodiestereo fra il fosfato legato al C5’ di ogni nuovo nucleotide aggiunto e il gruppo OH legato al C3’ dell’ultimo nucleotide della catena che si sta formando; tale sintesi avviene cioè allungando la catena in direzione 5’3’; non è nota alcuna DNA-polimerasi capace di agire in direzione opposta, cioè di allungare la catena dal 3’ verso il 5’;

gli inneschi (primers): tutte le DNA-polimerasi conosciute sono in grado di aggiungere nucleotidi soltanto ad un 3’-OH di una catena pre-esistente: affinché la DNA-polimerasi possa iniziare il suo lavoro, vengono sintetizzati da un apposito enzima (PRIMASI) delle catene oligonucleotidiche di RNA (da qualche unità a una decina di nucleotidi, a seconda degli organismi), denominate “inneschi” (primers) le cui basi si appaiano a quelle dello stampo

L’RNA

Quale è la differenza tra l’RNA e il DNA? CH3 timina L’ RNA ha l’uracile al posto della timina 17

DNA RNA L’ RNA ha il ribosio al posto del desossiribosio Base azotata 5’ P P P O O Desossiribosio OH H L’ RNA ha il ribosio al posto del desossiribosio Base azotata RNA 5’ P P P O O Ribosio OH OH 18

Gli RNA cellulari sono singole catene polinucleotidiche, che possono tuttavia ripiegarsi formando tratti a doppia elica

L’enzima che sintetizza i primers, chiamato “primasi” è una RNA-polimerasi: infatti gli inneschi sono fatti di ribonucleotidi, e non di desossiribonucleotidi. La primasi non necessita di alcun innesco per iniziare la sintesi.

Perché la duplicazione possa iniziare, è necessario che le due catene del DNA che devono fare da stampo si separino…... La separazione delle due catene della doppia elica del DNA è catalizzata da una elicasi

Affinché tutto il processo della duplicazione possa svolgersi in modo regolare, sono necessarie molte altre proteine…

Ma la sintesi del DNA ad opera della DNA polimerasi avviene in direzione 5’3’ !!! ????? Direzione sintesi (direzione forcella replicazione) 5’ 3’ 5’ 3’

PROPRIETA’ COMUNI ALLE DNA-POLIMERASI I e III Le DNA Polimerasi di E. coli PROPRIETA’ COMUNI ALLE DNA-POLIMERASI I e III richiedono una catena-stampo aggiungono nucleotidi ad un terminale 3’OH già esistente, ossia richiedono un innesco utilizzano per la sintesi monomeri “attivati”, ossia desossiribonucleosiditrifosfati (che possiedono l’energia necessaria a formare ogni nuovo legame estereo sottoforma di legami P-P ad alta energia); questo ha come conseguenza che le DNA-polimerasi procedono sempre in direzione 5’ 3’ possiedono un’attività esonucleasica 3’5’ detta anche “proof-reading” (correttore di bozze), che rimuove ogni nucleotide appena aggiunto che non sia correttamente appaiato allo stampo, permettendo quindi l’aggiunta di un nuovo nucleotide.

Le DNA polimerasi di mammifero

Le DNA polimerasi sono processive, catalizzano cioè molte polimerizzazioni ogni volta che si attaccano al DNA presenza di un “morsetto” proteico che, legandosi al DNA dietro la DNA polimerasi, fa sì che questa sia strettamente associata al nuovo filamento.

La sintesi del DNA E’ SEMICONSERVATIVA E’ BIDIREZIONALE E’ ASIMMETRICA (cioè avviene con modalità diverse sui due filamenti-stampo parentali) PROCEDE IN DIREZIONE 5’ 3’ (cioè ogni nuovo nucleotide si lega con legame fosfodiestereo al 3’OH del nucleotide precedente) HA UN SISTEMA DI CONTROLLO DEL CORRETTO APPAIAMENTO PER OGNI NUOVO NUCLEOTIDE AGGIUNTO (“correzione di bozze”, o attività esonucleasica 3’5’)

Il ruolo delle topoisomerasi nella replicazione del DNA La topoisomerasi è necessaria per evitare il problema del superavvolgimento che avviene a monte della bolla di replicazione durante lo srotolamento della doppia elica del DNA.

La DNA girasi (topoisomerasi II dei batteri) rimuove superavvolgimenti positivi che normalmente si formano a valle della forcella di duplicazione

Le molecole di DNA circolare duplicate sono separate tra loro da topoisomerasi di tipo II

I telomeri sono delle strutture formate da DNA e proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari costituiti da ripetizioni in tandem della sequenza TTGGGG

Sequenze ripetitive Le TELOMERASI impediscono l’accorciamento progressivo dei cromosomi eucariotici nel corso delle duplicazioni aggiungendo ripetizioni telomeriche ad ogni ciclo di sintesi del DNA

ALTERAZIONI DEL DNA E MECCANISMI DI RIPARAZIONE

La duplicazione del DNA è un processo che commette errori ( 1 errore ogni 105 bp), ma fortunatamente ci sono 3 meccanismi di riparazione del DNA: a) Attività di “correzione di bozze” della DNA polimerasi che corregge gli errori man mano che vengono commessi b) Riparazione dei disappaiamenti (correzione appaiamenti sbagliati) c) Riparazione per escissione (basi anomale) Essi garantiscono una frequenza di errori molto bassa ( 1 errore ogni 1010 bp) Tuttavia, alterazioni delle basi del DNA, spontanee o causate da agenti esterni, possono verificarsi e se non riparate dare origine a mutazioni.

Le alterazioni più comuni Errati appaiamenti (mismatch) dovuti a forme tautomeriche (rare) delle basi: ad es. la Citosina, nella sua forma tautomerica iminica (anziché aminica), può formare legami idrogeno (e quindi appaiarsi) con l’Adenina anziché con la Guanina Deaminazione delle basi: la perdita di un gruppo aminico le trasforma in basi anormali del DNA che vengono pertanto riconosciute (adenina diventa ipoxantina; guanina diventa xantina; citosina diventa uracile), rimosse e sostituite; Danni ingombranti che alterano la geometria del DNA, come i dimeri di timina

La deaminazione delle basi porta alla formazione di mutazioni puntiformi spontanee

Le alterazioni più comuni Errati appaiamenti (mismatch) dovuti a forme tautomeriche (rare) delle basi: ad es. la Citosina, nella sua forma tautomerica iminica (anziché aminica), può formare legami idrogeno (e quindi appaiarsi ) con l’Adenina anziché con la Guanina Deaminazione delle basi: la perdita di un gruppo aminico le trasforma in basi anormali del DNA che vengono pertanto riconosciute (adenina diventa ipoxantina; guanina diventa xantina; citosina diventa uracile), rimosse e sostituite; Danni ingombranti che alterano la geometria del DNA, come i dimeri di timina

Che cos’è e come si forma un dimero di timina

Basi chimicamente modificate, come dimeri covalenti timina-timina, ed altre lesioni “ingombranti” del DNA, possono essere riparate dal sistema di riparazione per escissione di nucleotidi (nucleotide excision repair) Riparazione di un dimero di timina da parte del sistema di riparazione per escissione di nucleotidi

I sistemi di riparo sono in grado di distinguere la catena alterata di DNA da quella intatta in quanto quella che porta il danno generalmente assume una struttura non presente normalmente Esistono alcune malattie genetiche relative a difetti nei geni che codificano per le proteine coinvolte nei sistemi di riparazione del DNA. Data l’importanza di questi sistemi per l’integrità del patrimonio genetico delle cellule, la maggior parte di questi difetti non è noto proprio perché non compatibile con la vita.

Nell’uomo sono noti tuttavia alcuni difetti genetici (rari) nei sistemi di riparazione per escissione di nucleotidi: un gruppo di questi difetti con conseguenze cliniche simili è noto come Xeroderma pigmentosum Lesioni della pelle causate dai raggi UV in un bambino affetto da Xeroderma pigmentosum

Tipi di danno al DNA e possibili cause

I cancerogeni chimici reagiscono col DNA direttamente oppure dopo attivazione metabolica, e l’effetto cancerogeno correla con la loro mutagenicità

Il danno al DNA, la riparazione e il loro ruolo nella cancerogenesi Una sequenza di DNA può essere cambiata copiando errori introdotti dalla DNA polimerasi durante la replicazione e/o da agenti ambientali come mutageni chimici o radiazioni Se non corretti, tali cambiamenti possono interferire con le funzioni cellulari Il danno al DNA può essere riparato attraverso diversi meccanismi biochimici Poiché tutti i cancerogeni causano cambiamenti nella sequenza del DNA, il danno al DNA e la sua riparazione sono aspetti importanti nello sviluppo del cancro I sistemi di riparazione del DNA sono molto simili nei procarioti e negli eucarioti

Questa informazione è organizzata in unità funzionali che sono i GENI. Il DNA contiene, sottoforma di sequenze di desossiribonucleotidi, le informazioni per costruire le proteine costituite da sequenze di aminoacidi. Questa informazione è organizzata in unità funzionali che sono i GENI. L’RNA, o meglio gli RNA, servono nel meccanismo cellulare che permette poi di scegliere e legare assieme degli aminoacidi nella sequenza corretta per costruire le proteine codificate dai geni (ipotesi del messaggero e dell’adattatore)