Anno Accademico Attività a scelta: 4 cfu Orario lezioni: lunedì e mercoledì ore 14,00-16,00 Aula G2B Proff. P. Malaspina, C. Gargioli, G. Cestra ORGANISMI MODELLO

Gli organismi modello sono utilizzati dall’inizio della genetica per studiare tutti i processi biologici fondamentali della cellula e degli organismi Presupposto: i meccanismi molecolari di base sono estremamente conservati nel corso dell’evoluzione La genomica comparata permette di conoscere le relazioni tra i diversi organismi e la possibilità di estrapolare i processi biologici degli organismi modello ad altri organismi Possono essere studiati tal quali o essere modificati geneticamente per studiare l’effetto fenotipo di una mutazione Attualmente possono essere utilizzati per la scienza di base e per la ricerca applicata (produzione molecole utili o sperimentazione di terapia genica o terapia farmacologica) ORGANISMI MODELLO

Pisum sativum - Ereditarietà dei caratteri; geni e alleli; nascita della genetica Neurospora – Segregazione dei cromosomi durante mitosi e meiosi; analisi della ricombinazione Drosophila – Teoria cromosomica dell’ereditarietà; struttura dei cromosomi (cromosomi salivari politenici); mappatura cromosomi attraverso ricombinazione ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica

E. coli – Mappatura dei geni; decifrazione del codice genetico; processi di trascrizione e traduzione. Regolazione genica ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica Zea mays – Genoma dinamico: gli elementi trasponibili

ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili nel mais 1940: la scoperta di Barbara McClintock premio Nobel per la Medicina nel 1983 Pigmentazione normale viola delle cariossidi (antociani). Ceppo di mais con cariossidi a fenotipo variegato. Analisi citogenetiche: cromosoma 9 con elevata frequenza di rottura se presenta Ds Ds (dissociazione): elemento trasponibile che favorisce la rottura del cromosoma 9; Ac (attivatore): attiva la rottura Espressi gli alleli recessivi Ds nel gene C (inattivato) Rimozione di Ds ad opera di Ac

1940: la scoperta di Barbara McClintock premio Nobel per la Medicina nel 1983 Fenotipi prodotti dagli elementi trasponibili nelle cariossidi c-m (Ds)= gene c mutato da Ds Se non è presente Ac, Ds non si muove: colore assente uniforme Se è presente Ac, Ds si può muovere: alcune cariossidi con colore a macchie Raro: Se Ac è presente nel gene C il sistema è sempre instabile e tutte le cariossidi a macchie

ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili nei procarioti I trasposoni presenti in tutti gli organismi ma differiscono nelle diverse specie. Numerosi IS, diversa dimensione Producono mutazioni ( delezioni o inversioni) Composto: IS10 = IS contiene gene trasposasi, solo uno è attivo. Semplice: IR,Trasposasi + revolvasi (ricombinazione)

ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili negli eucarioti - Classe dei retrotrasposoni - Classe dei trasposoni a DNA - Retrotrasposoni in lievito e Drosophila meccanismo retrovirale per inserzione in nuovo locus

ORGANISMI MODELLO nell’era pre-genomica Il genoma dinamico: gli elementi trasponibili nella specie umana Esempio della presenza di elementi trasponibili negli introni di un gene umano (selezione negativa per presenza in esoni). La maggior parte ha perso capacità di trasporsi per meccanismi ospite (es RNAi che silenziano trasposasi).

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici Embriologia e sviluppo animale: anfibi (rana, tritone, rospo Xenopus); riccio di mare; pollo Elettrofisiologia e neurobiologia: molluschi (calamaro e aplysia) Neurobiologia e sviluppo animale: nematode Caenorhabditis elegans

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici I primi studi sullo sviluppo embrionale: manipolazione fisica di embrioni, cellule e tessuti La scoperta degli organizzatori embrionali negli animali Il destino cellulare può essere modificato in tempi precoci. Cellule dell’organizzatore producono “morfogeni” che inducono risposte nei tessuti circostanti in modo dipendente dalla loro concentrazione Ma che molecole sono i “morfogeni” ? Labbro dorsale del blastoporo embrione Trapianto in ectoderma ventrale di un ricevente Anfibio Pulcino Cellule blastoporo mantengono proprie caratteristiche: formazione di un secondo asse ventrale ed embrione completo Zona di Attività Polarizzante = ZPA Doppia ZPA Zona di sviluppo arto

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici Mutanti di Drosophila e controllo genetico dello sviluppo Calvin Bridges (1915) osservò un moscerino con un fenotipo mutante con 2 coppie di ali e lo soprannominò Bithorax Antennapedia: zampe al posto delle antenne Mutazioni omeotiche (simili): una parte del corpo è trasformata in un’altra

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici Lo studio dello sviluppo embrionale attraverso l’approccio molecolare La scoperta dei geni omeotici, i geni che regolano lo sviluppo tridimensionale (antero-posteriore e dorso-ventrale) e temporale di tutto il regno animale Drosophila: otto loci Hox che influenzano identità dei segmenti e delle appendici definendo l’intera struttura corporea. Complessi Bithorax e Antennapedia sul terzo cromosoma. L’ordine dei geni corrisponde all’ordine delle regioni in senso antero-posteriore

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici Le proteine codificate dai geni Hox (fattori di trascrizione) si legano al DNA ed esercitano il loro effetto controllando l’espressione dei geni per lo sviluppo dei segmenti e delle appendici. Mutazioni in questi geni producono lo sviluppo di una struttura in un segmento sbagliato Le proteine codificate dagli 8 geni Hox hanno sequenze comuni tra cui un omeodominio di 60 aa composto da 3 eliche. Le eliche 2 e 3 formano il motivo helix-turn-helix

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici Geni Hox nel topo (nei mammiferi): da un singolo cluster a quattro Geni espressi in modo sequenziale lungo l’asse antero-posteriore I geni omeotici sono espressi in modo parzialmente sovrapposto

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici L’ordine dei geni Hox è equivalente all’ordine delle parti del corpo in cui sono espressi

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici Le proteine Hox di Drosophila e dei vertebrati mostrano notevoli similarità

ORGANISMI MODELLO per lo studio di aspetti biologici ZPA: cellule che producono la proteina Sonic Hedgehog (Shh) il “morfogeno” che diffonde e determina un gradiente controllando l’espressione dei geni Hox D per lo sviluppo dell’arto, Le cellule più vicine alla ZPA formano dita più piccole nei vertebrati (sia mani che piedi) Trapianto di altra ZPA o pallina rivestita con Shh o ac. retinoico determina attivazione geni Hox D e sviluppo arto Morfogeni: fattori di trascrizione o componenti di vie di segnalazione che agiscono direttamente (sulle cellule adiacenti) o indirettamente (interazione con recettori nucleari che si legano a promotori) sull’espressione genica (es: ac. Retinoico)

Principali caratteristiche per essere un buon organismo modello - Utilizzo economico -Possibilità di allevarlo (o coltivarlo) in condizioni controllate di laboratorio in poco spazio - Ciclo di riproduzione rapido - Progenie numerosa - Sequenza del suo genoma nota -Caratteristiche che permettano applicazioni di tecniche di biochimica, genetica e biologia molecolare Come scegliere un organismo modello? ORGANISMI MODELLO

ESEMPI DI ORGANISMI MODELLO Procarioti unicellulari: E. coli Eucarioti unicellulari: S. cerevisiae (lievito di birra) Eucarioti multicellulare: N. crassa (muffa del pane) Eucarioti: A. thaliana (pianta angiosperma) Eucarioti: C. elegans (invertebrato, verme Nematode) Drosophila melanogaster (invertebrato, insetto) Danio rerio (vertebrato, pesce) Xenopus (vertebrato, anfibio) Gallus gallus (vertebrato, uccello) Mus musculus e Rattus norvegicus (vertebrati, mammifero)

ORGANISMI MODELLO Con la genomica comparata è possibile: -conoscere le relazioni tra i diversi organismi e costruire alberi filogenetici molecolari delle specie esistenti e capire quali processi abbiano plasmato un genoma permettendogli di evolvere - identificare il DNA funzionale e quello non funzionale - identificare le regioni genomiche fortemente conservate

IL SEQUENZIAMENTO DEI GENOMI

FILOGENESI SEMPLIFICATA DEGLI EUCARIOTI E DEI METAZOI

FILOGENESI SEMPLIFICATA DEI VERTEBRATI Circa 800 milioni di anni fa

RICOSTRUZIONE DI UN ALBERO FILOGENETICO Allineamento di 50 aa N- terminali di globine epsilon di 7 vertebrati Matrice delle distanze. Es. uomo-scimpanzè 1/50aa, frazione = 0,02Albero filogenetico di tipo UPGMA

L’aumento della complessità è dovuto a duplicazione genica e divergenza

L’aumento della complessità è dovuto alla duplicazione genica: la superfamiglia delle globine nei vertebrati Monomeri Tetramero

DIVERGENZA FUNZIONALE DEI GENI DUPLICATI Nuova funzione Espressione in tessuti diversi

EVOLUZIONE DEI MAMMIFERI ATTRAVERSO IMPORTANTI RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI Separazione delle linee umana e murina: 75 mya 80% di tutti i geni umani e murini sono identificabili come ortologhi: le proteine sono essenzialmente le stesse. Regioni di sintenia: regioni genomiche che contengono gruppi di geni simili, spesso disposti nello stesso ordine (in celeste) o in ordine inverso (in verde)

EVOLUZIONE DEI MAMMIFERI ATTRAVERSO IMPORTANTI RIARRANGIAMENTI CROMOSOMICI SINTENIA: CONSERVAZIONE DELL’ORDINE LUNGO IL CROMOSOMA DI GENI ORTOLOGHI IN UOMO E TOPO

1990 – 2003: il sequenziamento del genoma umano Partecipazione di 20 centri di ricerca in USA, Europa, Giappone, Cina Obiettivi: 1) sviluppo di tecnologie per mappatura e sequenziamento 2) costituzione di banche dati pubbliche

99,7% del genoma eucromatico  geni distinti codificanti per proteine molte più proteine che geni!

GENOMICA COMPARATA: NON ESISTE UNA RELAZIONE TRA COMPLESSITA’ DI UN ORGANISMO E IL SUO NUMERO DI GENI SpecieTipoDimensioni del genoma (Mb) Numero di geni strutturali H. sapiensUomo3100  D. melanogasterMoscerino della frutta 169  C. elegansNematode100  Tetrahymena termophila Protozoo cililato 104> A. pisumAfide piante del pisello 517>34.666

GENETICA CLASSICA (FORWARD): osservazione di un fenotipo mutante spontaneo, individuare il gene in cui si è verificata la mutazione e determinare la proteina codificata Approcci: - inducendo mutazioni a caso nel genoma e cercando il gene associato al fenotipo - con inserzione casuale di sequenze retrovirali o trasposoni GENETICA INVERSA (REVERSE): conoscendo una molecola (sequenza di DNA, RNA o una proteina) cercare di capire la funzione del gene n ell’organismo Approcci: - mutagenesi specifica nel gene d’interesse - creando fenocopie: stesso fenotipo mediante interferenza mRNA antisenso (mutazione non trasmissibile ad altre cellule o nella linea germinale) APPROCCI PER LO STUDIO DELLA RELAZIONE GENE-FENOTIPO

CLASSEVANTAGGISVANTAGGI E LIMITI Primati non umaniMolto simili all’uomo a livello biochimico, fisiologico, genetico; importanti per le neuroscienze Eticamente inaccettabili per molti; alti costi; progenie ridotta Altri mammiferiSimili per alcuni aspetti (pecore e maiali); topi e ratti facili da manipolare, generazioni brevi, alta numerosità progenie Non sono buoni modelli per funzioni cerebrali, es malattie come Alzheimer, breve vita per studio m. insorgenza tardiva Altri vertebratiPollo, Zebrafish, Xenopus, buoni per sviluppo embrionale; bassi costi, Zebrafish: embrione piccolo per manipolazioni Xenopus: genoma tetraploide Pollo: numero individui limitato InvertebratiC. elegans, Drosophila. Bassi costi; facile analisi genetica Molto distanti evolutivamente dall’uomo