Giuseppe Montalenti

Adriano Buzzati Traverso

Il mutante bobbed e la magnificazione dell'rDNA

Tab. XI : MAGNIFICAZIONE P - Xbb (80) / Ybb+ x XXbb+ (320) / Ybb° F1 - Xbb(80) / Ybb° : fenotipo bobbed forte (circa 120 copie) - pre F2 - stesso genotipo : fenotipo bobbed lieve ( 160 copie ) - m1 F3 - stesso genotipo : fenotipo selvatico ( 160 copie ) - m2 …………………………………………………………………………………….. Fn - stesso genotipo : fenotipo selvatico ( 160 copie ) - mn* *da m2 a mn nessuna differenza osservabile ne fenotipica ne genotipica

Diagram illustrating a working hypothesis on the first steps of rDNA magnification.

Tab. XII : REVERSIONE P - Xbb pre / Ybb° x XXbb+ / Ybb+ F1 - Xbb pre / Ybb+ : attese 280 copie, presenti 240 F2 - stesso genotipo : attese 240 copie, presenti 240 ………………………………………………………………….. P - Xbbm2 / Ybb° x stesso maschio di cui sopra F1 - Xbbm2 / Ybb+ : attese 320 copie, presenti 280 F2 - stesso genotipo : attese 280 copie, presenti 280 …………………………………………………………………... P - Xbbm7 / Ybb° x stesso maschio di cui sopra F1 - Xbbm7 / Ybb+ : attese 320 copie, presenti 320 F2 - stesso genotipo : attese 320 copie, presenti 320 …………………………………………………………………. Utilizzando lo stesso schema attese 320 copie, presenti 320 Con mn > 7

Schematic representation of the proposed method for the isolation of tandemly duplicated genes

Schematic representation of the formation of rings when the duplicated sequences are scattered along the same chromosome

Il DNA come strumento per la realizzazione di nanomateriali Ronald Hoffmann scrive nel 1994 sulla rivista American Scientist “Il sistema dell’acido nucleico che opera nella vita terrestre incarna la chimica. Perché allora non utilizzarlo…per permettere agli esseri umani di creare qualcosa di nuovo, intrinsecamente bello, certamente utile, anche se ovviamente non sarà un prodotto naturale”

I legami specifici delle coppie di basi del DNA costituiscono le fondamenta chimiche della genetica. Questo unico e potente sistema di riconoscimento molecolare è stato recentemente utilizzato anche nelle nanotecnologie per dirigere l’assemblaggio di materiali altamente strutturati a dimensione nanometrica.

Fate clic per modificare il formato del testo della struttura Secondo livello struttura  Terzo livello struttura Quarto livello struttura  Quinto livello struttura  Sesto livello struttura  Settimo livello struttura  Ottavo livello struttura Nono livello strutturaFare clic per modificare stili del testo dello schema Fate clic per modificare il formato del testo della struttura Secondo livello struttura  Terzo livello struttura Quarto livello struttura  Quinto livello struttura  Sesto livello struttura  Settimo livello struttura  Ottavo livello struttura Nono livello strutturaFare clic per modificare stili del testo dello schema ▫ Secondo livello  Terzo livello  Quarto livello ▫ Quinto livello Fate clic per modificare il formato del testo della struttura Secondo livello struttura  Terzo livello struttura Quarto livello struttura  Quinto livello struttura  Sesto livello struttura  Settimo livello struttura  Ottavo livello struttura Nono livello strutturaFare clic per modificare stili del testo dello schema ▫ Secondo livello  Terzo livello  Quarto livello ▫ Quinto livello La molecola di DNA: Caratteristiche strutturali  Lungo polimero formato da unità ripetute di nucleotidi  Esiste in forma di doppia elica destrorsa  Piccole dimensioni: diametro 2 nm, ripetizione strutturali 3,4-3,6 nm  Specificità dell’appaiamento delle basi: Adenina-Timina, Citosina-Guanina  Gli scheletri zucchero - fosforo dei due filamenti complementari sono antiparalleli

Perché utilizzare il DNA  Struttura semplice, composizione semplice  dsDNA rigidità strutturale fino ai 50 nm  ssDNA grande flessibilità meccanica  Elevata stabilità chimico-fisica  Disponibilità di metodi per determinare e sintetizzare sequenze di DNA  Disponibilità di enzimi per il processamento del DNA a dimensione atomica

1°obiettivo: ottenere dalla lineare molecola del DNA una struttura ramificata Seeman riproduce in vitro la giunzione di Holliday intermedio della meiosi cellulare per formare una giunzione a quattro bracci Strutture 2D: approccio storico basato su assemblaggio di singole “mattonelle” Meccanismo di ricombinazione tra molecole di DNA omologhe: formazione giunzione di Holliday Giunzione di Holliday: struttura 3D 2° obiettivo: unire i singoli mattoni “tile” per costruire strutture 2D reticoli Assemblaggio intermolecolare realizzato tramite sticky end “terminali appiccicosi”: breve sequenza a s-strand che si estende dal dsDNA Autoassemblaggio di DNA ramificato in un cristallo a due dimensioni La flessibilità della giunzione risolta da Seeman tramite i motivi “DX” double-crossover. Sopra: mattonelle DX DNA con giunzioni a quattro e tre bracci. Sotto: lattici periodici 2D con cavità quadrata ed esagonale

Esagono 2D con vertici rigidi e lati di dsDNA..Esagono con sei nanoparticelle di Au ai vertici. Triangolo di DNA con Cu(I)(dpp)2-DNA ai vertici Un lungo filamento di DNA è ripiegato nella struttura desiderata con l’aiuto di strand stabilizzanti, dando luogo a una faccina sorridente o a una stella. Altri possibili approcci:  DNA “origami”: un DNA virale ss-strand è ripiegato più volte su se stesso in un pattern determinato. Blocco della struttura realizzato con l’aggiunta di piccoli strand con funzione di “graffette”. Strutture non periodiche 2D  DNA e molecole sintetiche: molecole organiche e inorganiche come punti di coniugazione: gli scaffold di DNA appaiono più dinamici e di minori dimensioni

Assemblaggio tridimensionale del DNA Costruendo a partire dai tre precedenti approcci sono state realizzate diverse nanoarchitetture 3D Qualche esempio: Scatolo a DNA origami. L’addizione di un filamento di DNA con funzione di “chiave” comporta l’aperturra del coperchio rilasciando il suo contenuto. Prismi triangolari, cubi, prismi pentamerici ed esamerici, eteroprismi e biprismi realizzati a partire da poligoni planari di ssDNA Prisma triangolare dinamico Giunzioni a tre e a cinque braccia assemblate in un tetraedro, ottaedro, un icosaedro e una forma buckyball La rigida struttura di mattonelle cross-over presenta ss-strand nelle giunzioni per permettere le desiderate curvature

Assemblaggio di nanotubi Tre approcci possibili: 1. Si crea un array 2D di DNA e se ne provoca l’avvolgimento su se stesso per formare una struttura tubolare L’array 2D di DNA si ripiega in una struttura tubolare grazie alle repulsioni tra le particelle d’oro disposte in superficie.

Assemblaggio di nanotubi Tre approcci possibili: Si intrecciano differenti catene di DNA a doppio strand generando punti di interconnessione specifici per fornire fasci di eliche, che poi mediante sticky end sono allungate per formare nanotubi Sei doppie eliche di DNA sono legate da punti cross-over separati da nucleotidi, che inducono un angolo diedro di 120° per coppia.

Assemblaggio di nanotubi Tre approcci possibili: Si generano blocchi singoli di DNA ciclico che vengono interconnessi longitudinalmente tramite sticky end a formare nanotubi DNA nanotubi geometricamente definiti a forma triangolare o quadrata realizzati sia a doppio che a singolo strand con differente rigidità. DNA nanotubo a diametro variabile. L’incapsulamento è selettivo per le nanoparticelle d’oro.

Da strutture statiche a dispositivi dinamici: Meccanismo di “branch migration” o spostamento dello strand: Quando un duplex di DNA presenta uno strand con un’ estremità libera “toe hold” questo può ibridizzare con un secondo strand del tutto complementare a tutta la sequenza del primo portando a un duplex perfetto energeticamente più favorevole. Ne consegue la modifica della struttura preesistente. Nanopinze a DNA

Lo stato conformazionale di ciascuna unità (PX o JX2) determina quale dei due motivi a metà esagono di una coppia è posizionato su l’uno o l’altro lato dell’arrangiamento lineare di DNA. Principio di funzionamento alla base della nanomacchina a DNA PX, JX2 Seeman e collaboratori partirono da mattonelle di cross-over capaci di cambiare fra la conformazione PX (PX, paranemic-crossover) e il suo topoisomero JX2 (JX2, double- junction).. La sostituzione dei filamenti coinvolti nel cross-over centrale induce la rotazione di 180° delle coppie di sticky end nel motivo PX

La presenza dell’ adenosina induce l’appaiamento e la compattazione dell’aptamero che la riconosce, facilitando il trasferimento di carica nel tratto Detector In assenza dell’analita (adenosina) entrambi i sensori adottano conformazioni aperte, non strutturate, che consentono solamente il trasferimento di carica nel tratto “AQ” Due tipi di sensori: Integrated-Ligand “Sensor” e Coupled-Ligand “Sensor” Realizzati tramite l’assemblaggio di tre elementi costruttivi: una sequenza aptamero un braccio “Detector” uno “AQ” steam (antrachinone ossidato legato covalentemente) Nel sensore integrato il loop aptamerico interrompe la doppia elica nel tratto di congiungimento delle due braccia “AQ” e “Detector” Un biosensore per l’adenosina: Nel sensore ligando accoppiato il dominio aptamer è adiacente ma separato dal percorso elettronico. Meccanismo: rilevazione di un flusso di elettroni lungo una doppia elica di DNA, permesso solo in caso di perfetta integrità del duplex “Aptamer”: corta sequenza di DNA capace di legarsi selettivamente a specie molecolari, non strutturata in soluzione, va incontro a compattazione a seguito del legame col ligando.

PROSPETTIVE E APPLICAZIONI Le possibili applicazioni delle nanorchitetture a DNA investono numerosi campi tra cui:  Le scatole e i nanotubi di DNA, materiali biodegradabili e biocompatibili, possono essere usati in biomedicina per il carico, il trasporto, la modificazione e il rilascio di sostanze incapsulate quali proteine, anticorpi, farmaci o diverse nanoparticelle.  Il meccanismo di riconoscimento molecolare permette la costruzione di architetture che espongono siti di legame specifici per atomi e molecole, facendone ossatura per l’organizzazione di materiali, per l’ingegneria tissutale, componenti di sistemi micromeccanici, interconnettori nella nanoelettronica o piattaforme per biocatalisi. In conclusione si può affermare che il DNA da dogma fondamentale dell’informazione genetica sta ora diventando un vero e proprio “materiale da costruzione”

The M. C. Escher woodcut Depth(picture) inspired Nadrian Seeman to consider using three- dimensional lattices of DNA to orient hard-to- crystallize molecules. This led to the beginning of the field of DNA nanotechnology.