SPETTROMETRIA DI MASSA E APPLICAZIONI UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II S.I.C.S.I. VII CICLO - CLASSE A013 LABORATORIO DI CHIMICA ANALITICA SPETTROMETRIA DI MASSA E APPLICAZIONI DOCENTE: Prof Andini

CLASSE DI RIFERIMENTO: 5° anno ITI ad indirizzo chimico PREREQUISITI: Gascromatografia Nozioni di chimica organica OBIETTIVI: comprendere i principi di funzionamento della spettrometria di massa conoscere una delle tante applicazioni della spettrometria di massa: il monitoraggio della diossina in atmosfera, spunto per lavori multidisciplinari

SPETTROMETRIA DI MASSA La spettrometria di massa è una tecnica analitica che permette di misurare la massa di una molecola Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in base al loro rapporto massa/carica (m/z)

SCHEMA DI UNO SPETTROMETRO DI MASSA rivelazione degli ioni cosi’ separati  spettro di massa generazione di ioni in fase gassosa separazione degli ioni in funzione del rapporto m/z spettro di massa : diagramma dell’abbondanza relativa degli ioni prodotti in funzione del rapporto m/z

IONIZZAZIONE Espulsione di e-: M M+. + e- Protonazione: M + H+ MH+ La scelta del metodo di ionizzazione è importante. Metodi diversi producono diversi tipi di ioni e, soprattutto, hanno efficacia diversa in funzione del tipo di molecole studiata. Espulsione di e-: M M+. + e- Protonazione: M + H+ MH+ Cationizzazione: M + Cat+ MCat+ Deprotonazione: MH M- + H+

IONIZZAZIONE Ionizzazione “hard” Ionizzazione “soft” Basso contenuto energia nello ione molecolare Eccesso di energia nello ione molecolare (rispetto alla energia di ionizzazione) Frammentazione limitata Estesa frammentazione ione molecolare radicale frammentazione

SPETTRO DI MASSA Diagramma a linee verticali In uno spettro di massa, l’asse delle X riporta valori rapporto m/z e l’asse delle Y valori di abbondanza relativa degli ioni analizzati. Picco Base Diagramma a linee verticali Ione Molecolare

IONIZZAZIONE frammentazione ioni frammento Ionizzazione “hard”

SPETTRO DI MASSA CH3 C O CH2 Dallo spettro di massa si può risalire alla struttura di un composto incognito, attribuendo ai singoli ioni composizione elementare e ricostruendo i meccanismi di frammentazione seguendo schemi tipici per le varie classi di composti. Picco Base CH3 C O CH2 m/z 43 m/z 57 Ione Molecolare - 29 - 15

INTERPRETAZIONE DI UNO SPETTRO DI MASSA Nella comune pratica di laboratorio, si suggerisce prima di tutto di eseguire un confronto computerizzato dello spettro appena registrato con il vasto archivio di spettri ormai disponibile su tutti gli spettrometri commerciali. Anche se la molecola esaminata non e' compresa nell'archivio, l'elaboratore elenca una serie di composti che contengono il maggior numero possibile di ioni comuni con lo spettro incognito. L'identificazione di ioni caratteristici e' uno stadio importante anche nell'interpretazione "manuale" degli spettri di massa: l'aiuto di un computer quindi non guasta.   Nell'interpretazione non assistita, normalmente si segue una procedura abbastanza semplice:

PICCHI ISOTOPICI La spettrometria di massa misura la massa di molecole singole, per cui la massa misurata dipende dagli effettivi isotopi presenti nella molecola M+1 1.1%(numero di C)+ 0.36%(numero di N) M+2 Cl (33% di M) Br (100% di M) S (4% di M)

Tabelle e Collezioni di spettri NIST02: 147198 spettri Wiley 7: 338322 spettri Wiley7/NIST02 combinate: 425000 spettri

MODALITA’ DI IONIZZAZIONE Hard Ionization: Ionizzazione elettronica (EI) Soft Ionization: Ionizzazione chimica (CI) Bombardamento con atomi veloci (FAB) Desorbimento laser assistito da matrice (MALDI) Ionizzazione elettrospray (ESI)

M (g) + e - -> M + (g) + 2 e – IONIZZAZIONE PER IMPATTO ELETTRONICO (EI) E’ la modalità più classica, tuttora molto utilizzata. E’ una ionizzazione ‘hard’. Il campione deve essere in stato di vapore. Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatili, termicamente stabili. Interfaccia con GC, anche HPLC. Sotto alto vuoto: 10-5-10-6 Tor M (g)  + e -    ->  M + (g)   +  2 e –

Il campione, in fase gassosa, viene bombardato, ad angolo retto, da un fascio elettronico, emesso da un filamento caldo Il repeller spinge rapidamente lo ione dalla sorgente verso la zona di accelerazione Gli ioni positivi vengono spinti attraverso la prima fenditura da un debole campo elettrostatico. Quindi un forte campo elettrostatico accelera gli ioni fino alla loro velocità finale

ANALIZZATORI Strumenti a settore Analizzatori di massa a quadrupolo Time-of-Flight (TOF)

ANALIZZATORE A SETTORE MAGNETICO L’analizzatore si trova all’interno di un campo magnetico, perpendicolare alla direzione del fascio di particelle cariche. Il campo magnetico fa curvare il fascio. Per un dato valore di campo magnetico B e di potenziale di accelerazione V a ciascun valore del rapporto massa/carica m/z corrisponde un raggio di curvatura r.

QUADRUPOLO Quattro barre parallele U corrente continua d.c. V cosωt voltaggio alternato r.f., dipendente dal tempo Per un dato valore dei potenziali solo gli ioni con un singolo valore del rapporto m/z raggiungono il rivelatore. La scansione di uno spettro si ottiene facendo variare simultaneamente d.c. e a.c., mantenendo costante il loro rapporto.

QUADRUPOLO Possono essere analizzati tutti gli ioni a tutte le masse o solo gli ioni aventi una determinata massa mass scanning mode m1 m3 m4 m2 single mass transmission mode m2 m3 m1 m4

TRAPPOLA IONICA Il processo di MS/MS in trappola ionica può essere descritto in 4 steps: Ionizzazione Isolamento dello ione padre Frammentazione per collisione indotta (CID) Analisi di massa degli ioni figlio prodotti

TRAPPOLA IONICA

DETECTOR La maggioranza dei rivelatori funzionano ad impatto ionico o per cattura ionica. Tutti i tipi richiedono una superficie che raccolga gli ioni e dove la carica venga neutralizzata sia per la raccolta sia per donazione di elettroni. Si realizza quindi un trasferimento di elettroni ed un flusso di corrente che può essere amplificato ed infine convertito in un segnale registrabile. La sensibilità può essere così elevata da permettere di rilevare un singolo ione.

APPLICAZIONE SPETTROMETRIA DI MASSA ANALISI DI MICROINQUINANTI ORGANICI

DIOSSINE L’emergenza diossina è iniziata in Campania nella primavera del 2002 a seguito del riscontro di livelli di diossina superiori ai limiti previsti dalla normativa comunitaria vigente (Reg.CE 2375/01) in due campioni di latte di massa ovicaprino. Secondo la letteratura internazionale, la principale fonte di esposizione (circa il 90%), per la specie umana, è rappresentata dalla presenza delle diossine negli alimenti ed in particolare i maggiori carrier alimentari sono le matrici grasse d'origine animale e, quindi, tutti gli alimenti che li contengono. Ecco come dalle fonti ambientali la diossina passa alle matrici alimentari

DIOSSINE Seveso 1976. Icmesa  nube tossica di diossina. Primi sintomi: infiammazioni agli occhi; quindi aborti spontanei e cloracne. Specifiche normative sui Rischi di Incedenti Rilevanti connessi con determinate attività industriali (normativa SEVESO) Era il 10 luglio 1976. Una nube si formò nel cielo di Seveso, da un incidenti nello stabilimento della Icmesa, per la produzione di intermedi chimici. Fu l’ inzio del più grave incidente ecologico che mai avesse colpito il Nord Italia. In quella nube c’era diossina, un prodotto altamente tossico. Le prime avvisaglie furono l'odore acre e le infiammazioni agli occhi. Alcune persone subirono delle degenerazioni della pelle (cosiddetta cloracne) mentre gli effetti sulla salute generale sono ancora oggi oggetto di studi. In questo quadro si è collocata l’emanazione nel 1982 della Direttiva n.501 sui rischi di incidenti rilevanti connessi con determinate attività industriali Direttive 82/501/CEE  DPR 17 maggio 1988, n. 175 (SEVESO I) Direttiva 96/82/CE  DLvo 17 agosto 1999, n. 334 (SEVESO II) Direttiva 2003/105/CE  DLvo 21 settembre 2005, n. 238 (SEVESO III) TCDD

DIOSSINE 210 composti chimici aromatici policlorurati PCDD PCDF 17 congeneri tossici che presentano gli atomi di cloro in posizione 2,3,7,8

Diossine - Tossicità La struttura delle diossine si adatta alle cavità di uno specifico recettore biologico (recettore Ah), e in questa forma è in grado di attraversare le membrane cellulari e di avviare così l’azione tossica. La tossicità è variabile in funzione del numero e delle posizioni degli atomi di cloro sostituenti. La presenza di sostituenti in posizione 2,3,7,8, rende la molecole particolarmente tossica

Diossine – Tossicità (I-TEF) Tossicità Equivalente:

Diossine - Fonti 2 principali meccanismi nella formazione di PCDD/F imperfetto processo di combustione negli impianti di incenerimento municipali, ospedalieri ed industriali a formare prodotti di combustione incompleta prodotti secondari indesiderati durante la produzione di particolari prodotti chimici organici clorurati: clorofenoli e loro derivati cloro difenil eteri e policloro difenili (PCB) la produzione di diossina risulta inevitabile nei processi di combustione di materia organica, poiché nelle combustioni è praticamente sempre presente il cloro

METODOLOGIA ANALITICA Campionamento Estrazione/Purificazione Analisi Strumentale

Spettrometro di massa EI a trappola ionica accoppiato a GC Analisi strumentale Diossine Spettrometro di massa EI a trappola ionica accoppiato a GC

Ioni figlio: [M-CO35Cl]+, [M+2-CO35Cl]+, [M+2-CO37Cl]+, [M+4-CO37Cl]+ MS/MS Ioni precursori: [M]+, [M+2]+ e [M+4]+ MS/MS (Precursor ion) (Product Ion) Ioni figlio: [M-CO35Cl]+, [M+2-CO35Cl]+, [M+2-CO37Cl]+, [M+4-CO37Cl]+

GC-MS L’interfacciamento GC-MS è ormai più che consolidato, in quanto l’eluato in fase gassosa pone assai meno problemi se immesso in un sistema ad alto vuoto. Il riconoscimento degli analiti è aiutato dai database di spettri di massa che possono contenere fino a 250.000 sostanze diverse

GC-MS L’informazione che si ottiene dal rivelatore a spettrometria di massa può essere gestita in modi diversi: nella modalità TIC (Total Ion Current) si misura, in ogni istante della corsa cromatografica, la corrente ionica totale generata dai vari ioni che si formano dal soluto in quell’istante nella modalità SIM (Single Ion Monitoring) si misura il segnale a m/z fissa; il cromatogramma che si ottiene indica la presenza soltanto dei soluti dai quali si genera un frammento avente quel valore di m/z in ogni istante del cromatogramma è inoltre possibile avere lo spettro di massa di ciò che sta passando in quel momento nello spettrometro di massa

Esempio di cromatogramma GC-MS tempo di ritenzione spettro di massa m/z m/z

Diossine Furani Diossine Furani marcati Diossine marcate