Immunologia Studio della risposta immunitaria, ovvero dei processi attraverso i quali gli esseri viventi si difendono dall’invasione di organismi esterni (virus, batteri, molecole) Quando gli esseri viventi sono invasi da organismi esterni si attiva una risposta immunitaria ( insieme dei processi attraverso i quali gli organismi si difendono)

Risposte immunologiche Risposte umorali (mediate da anticorpi) Risposte mediate da cellule In entrambe le risposte sono coinvolte le cellule del SISTEMA reticolo-linfocitario

Risposta umorale Antigene (Ag) ( organismo esterno o un composto chimico) entra nei tessuti di un animale I linfociti sono stimolati a dividersi e differenziarsi Produzione di plasmacellule, che secernono Anticorpi (Ab) (IgG)

Modalità di legame Ab-Ag Ab lega non covalentemente l’Ag Ag: macromolecola, tossina, microorganismo Precipitazione, neutralizzazione morte fagocitosi

STRUTTURA IgG) Un anticorpo (immunoglobulina) è una proteina con una peculiare struttura quaternaria che le conferisce una forma a "Y". Sono costituite da un gambo centrale e due bracci laterali

Anticorpi Sono proteine che appartengono al gruppo delle immunoglobuline Struttura: 4 catene polipeptidiche: 2 catene pesanti identiche che variano nelle 5 classi di immunoglobuline ( a, g, m, d, e) Le catene leggere sono solo 2 comuni a tutte le classi (k e l)

Proprietà chimico-fisiche delle classi di anticorpi

Immunoglobuline Le IgM sono responsabili della prima risposta contro un antigene, le IgG vengono prodotte in un secondo momento e sono probabilmente le immunoglobuline più efficaci nel riconoscere e legare l’antigene le IgA sono gli anticorpi presenti nelle secrezioni, nella saliva, nel muco bronchiale e nelle secrezioni gastro-intestinale. Le IgE, invece, sono le immunoglobuline responsabili delle risposte contro antigeni parassitari, solo recentemente prevale l'interesse per il ruolo svolto da tali Ig nella risposta allergica

catene leggere delle IgG sono costituite da: una regione variabile (VL):110 aa nella porzione ammino terminale della molecola una regione costante (CL) costituita da un centinaio di amminoacidi nella porzione carbossi terminale

catene pesanti delle IgG sono costituite da: una regione variabile (VH): 110 amminoacidi nella porzione ammino terminale tre regioni costanti (CH1, CH2, CH3) nella regione C-terminale (350-400 amminoacidi).

costante (CL, da circa 100aa, nella regione carbossiterminale). Gli anticorpi(IGg) sono formati da due tipi di catene : catene leggere e pesanti legate da S-S La catena leggera L è costituita da: una regione variabile (VL, di circa 100 aa), nella regione amminoterminale e da una regione costante (CL, da circa 100aa, nella regione carbossiterminale). Anche la catena pesante presenta una regione variabile (VH,110 aa, nella regione NH2terminalea) e tre regioni costante (CH1, CH2, CH3) al C-terminale di circa 350-400aa Le catene variabili presentano sequenze aa ad alta variabilità coinvolte nel legame con ag

Tecniche immunochimiche Utilizzano anticorpi IgG che costituiscono 80% delle immunoglobuline del siero Vantaggio: elevata specificità tra Ab e Ag

Principio su cui si basano le tecniche immunochimiche La reazione Ag-Ab può dar luogo alla formazione di un complesso Ag-Ab ad altissimo PM, ch diventa insolubile e precipita Precipitazione Ab-Ag: è visibile ad occhio nudo

Dosaggio del immunoprecipitato Ag-Ab solubile Tecniche centrifugative Tecniche torbidimetriche

1: Se il complesso Ab-Ag è solubile: Miscelazione e centrifugazione della soluzione Precipitato : complesso Ag-Ab visibile

2-Complesso Ag-Ab non completamente solubile Può essere precipitato: Aggiunta di un secondo Ab, capace di precipitare il primo Ab Aggiunta di proteina A da Staphilococcus aureus, capace di legarsi alle IgG

Formazione dell’immunoprecipitato Ag-Ab e dosaggio

Metodica IMMUNOPrecipitazione in fase libera Misurare la concentrazione di immunoprecipitato Ag-Ab Ad una soluzione fissa di Ab aggiungo quantità crescenti di Ag riporto in grafico la quantità di Ppt Ag-Ab in funzione di quantità crescenti di Ag

antigene solubile viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici. La formazione degli immunocomplessi si può osservare con un precipitato

Curva di precipitazione complesso Ag-Ab La curva ottenuta può essere suddivisa in tre zone: zona di eccesso di anticorpo, in cui l'aggiunta di antigene porta ad un aumento proporzionale della quantità di precipitato; · zona di equivalenza in cui si ha la massima concentrazione di precipitato del complesso antigene/anticorpo; zona di eccesso di antigene in cui il precipitato si ridiscioglie

x Dosaggio del Precipitato Ag-Ab Dopo aver ottenuto nella zona di equivalenza il Ppt Ag-Ab viene isolato x centrifugazione quantizzato metodi diversi o se Ab è marcato 131I mediante metodi radioisotopici )

Immunodiffusione Quando l'immunoprecipitazione avviene all'interno di un gel si parla più propriamente di immunodiffusione. utilizzato per il dosaggio di antigeni.

immunodiffusione Immunodiffusione radiale semplice, l'immunodiffusione doppia l'immunoelettroforesi

IMMUNO DIFFUSIONE RADIALE SEMPLICE Su un vetrino si pone un gel di agar contenente Ab Sul gel scavo dei pozzetti circolari (2-4mm) Nei pozzetti aggiungo quantità crescenti di Ag Man mano che l’antigene diffonde radialmente dai pozzetti, viene a contatto con Ab presente nell’agar Si forma un anello di precipitazione che si allarga fino al punto di equivalenza Quando il diametro dell’anello resta costante vuol dire che ho raggiunto il punto di equivalenza Il diametro dell’anello è proporzionale alla concentrazione di Ag Costruisco retta di taratura (diametro anello in funzione quantità crescenti di Ag) Nell’ultimo pozzetto metto il campione contenente Ag da dosare e dalla curva di taratura mi ricavo la sua concentrazione

Nei pozzetti carico Ag in quantità crescenti Ab in gel Nei pozzetti carico Ag in quantità crescenti Diametro anello di precipitazione è direttamente proporzionale alla conc.Ag Riporto in grafico il diametro dell’anello ( area del cerchio) in funzione [Ag] crescenti e note : retta di taratura x determinare la concentrazione Ag incognita

Immunodiffusione doppia in due dimensioni(metodo di Ouchterlony). Tecnica nella quale sia Ag che Ab diffondono Consente di rivelare se: - se gli antigeni depositati nei diversi pozzetti hanno epitopi comuni (reazione di identità) se non hanno epitopi in comune (reazione di non identità) Se hanno almeno un epitopo comune (reazione di parziale identità)

Nel pozzetto centrale si può depositare l'anticorpo e nei pozzetti attorno i diversi antigeni. AgA ed AgB Anticorpo ed antigene diffondono nell'agar ed in corrispondenza del punto di equivalenza si forma l'immunoprecipitato Immunoprecipitato è una linea continua se AgA e AgB hanno gli stessi epitopi Immunoprecipitato forma due linee che si incrociano se gli Ag non hanno stessi epitopi e xciò sono diversi Immunoprecipitato forma una linea non continua se Ag A ha epitopi comuni con Ag B

Immunoelettroforesi (EI) è una tecnica che unisce la specificità della reazione di immunoprecipitazione con la separazione di molecole mediante elettroforesi

immunoelettroforesi gel d'agarosio su cui si creano due due solchi paralleli, che inizialmente sono coperti da agar + si scavano due pozzetti circolari Nei due pozzetti si depositano due diversi antigeni e si fa avvenire l'elettroforesi. Al termine dell'elettroforesi, le due incisioni parallele sono svuotate dall’agar e riempite con antisieri opportuni e si lascia in incubazione per una notte. Gli antigeni diffondono radialmente e gli anticorpi diffondono lateralmente dando quindi luogo ad archi di precipitazione,

tipi di immunoelettroforesi immunoelettroforesi quantitativa rocket elettroforesi l'immunoelettroforesi bidimensionale

Immunoelettroforesi quantitativa o rocket elettroforesi Nei pozzetti deposito diverse concentrazioni di Ag ed in uno campione con Ag a concentrazione incognita Sopra questo gel viene posto Ab specifico Applico corrente : Ab migrano al catodo, gli antigeni all’anodo Al punto di equivalenza si formeranno gli immunoprecipitati a forma di razzi o archi Più alto è il razzo , più alta è la concentrazione di Ag

Metodica Costruzione di una curva di taratura: Altezza degli archi in funzione della concentrazione di Ag Calcolo la concentrazione di Ag del campione incognito, utilizzando la retta di taratura Ag a concentrazioni diverse X, X2: Ag a conc incognita

l'immunoelettroforesi bidimensionale unisce la separazione elettroforetica di una miscela di sostanze (proteine, antigeni) con la specificità e la rapidità della rocket elettroforesi.

Metodica Su un gel di agar si scavano i pozzeti e si caricano quantità crescenti di Ag. In uno dei pozzetti si pone il campione a concentrazione di Ag incognita Elettroforesi x separare gli antigeni Al termine della corsa il gel viene trasferito su una lastra di vetro e adiacente al primi gel contenente gli Ag separati si fa solidificare uno strato d'agar contenente l’ anticorpo specifico si effettua una seconda elettroforesi in direzione perpendicolare alla precedente. Si formano così degli archi di precipitazione che hanno una forma simile ad un razzo o arco. Retta di taratura:Area degli archi in funzione quantità di Ag Area degli archi è proporzionale alla conc. Di Ag

Interazione anticorpo-antigene L'interazione tra un anticorpo e l'antigene, come, l'interazione tra una proteina e un ligando, può essere descritta dalla seguente relazione: Ka P + nL PLn Kd P è la proteina L è il ligando, PLn è il complesso, in questo caso antigene-anticorpo; n è il numero di siti di legame; Ka è la costante di affinità del legame anticorpo-antigene; Kd è la costante di dissociazione del complesso antigene-anticorpo ed è pari a 1/Ka.

i valori di n e di Ka si misurano, a concentrazione fissa di anticorpo: Importante determinare le concentrazioni della frazione libera di antigene e della frazione legata corrispondente.

Come discrimini tra ligando libero e complessato, la cromatografia ad esclusione, la dialisi all'equilibrio, Metodi immunoenzimatici competitivi (ELISA) e metodi radioimmunologici (RIA).

equilibrio di dialisi: una cella di dialisi.: formata da 2 scomparti Nello scomparto 1 metto Ag marcato con 14C a concentrazione incognita ( 1000cpm) Nello scomparto 2 metto Ab a concentrazione nota ( 10 mM) Rapporto stechiometrico di legame suppongo 1:1 Tra i 2 scomparti vi è una membrana semipermeabile che lascia passare solo 14C Ag Esso diffonderà nel secondo scomparto fino a che le concentrazioni nei 2 scomparti non saranno all’equilibrio. Nel primo scomparto se misuro la radioattività avrò 500cpm e così pure nel secondo scomparto. Ma quanta di questa radioattività è legata al complesso e quanta è libera? OSSIA Quanto Ag marcato è legato all’anticorpo e quanto è libero? separao il complesso da Ag libero per centrifugazione Nel Ppt otterrò il complesso Ag Ab marcato, ne misuro la radioattività ( 300cpm) Imposto la proporzione 500cpm:10mM= 300cpm:X X= concentrazione di 14CAgAb Nel sopranatante Ag libero e marcato, ne misuro la radioattività 200cpm Imposto la proporzione 500cpm:10mM= 200cpm:X X= concentrazione di Ag non legato

Scomparto 1 Scomparto 2 14C Ag a concentrazione incognita Ab 10mM 1000cpm il rapporto stechiometricodi legame Ag/Ab è 1:1 Diffusione di Ag marcato dal primo al secondo scomparto fino a che le concentrazioni saranno all’equilibrio Miscela contenente 14C AgAb complesso + 14C Ag libero 500cpm ( non so quanta radioattività è libera e legata 14CAg 500cpm

14CAg 500cpm Miscela contenente 14C AgAb complesso + 14C Ag libero 500cpm ( non so quanta radioattività è libera e legata) non so quanto Ag è in complesso con Ab e quanto è Ag libero Centrifugo tutta la miscela del 2 scomparto: Precipitato conterrà il complesso marcato, misuro la radioattività ( 300cpm) Sopranatante conterrà Ag marcato libero ( misuro la radioattività = 200cpm

A questo punto poiché nel Ppt ho il complesso 14CAgAb (300cpm) e sapendo che il rapporto stechiometrico è 1:1 so che la concentrazione di 14CAgAb è 10mM Mi calcolo la concentrazione di c14Ag libero nel secondo scomparto sapendo che è 200cpm(10mM) 300cpm :10mM di Ab= 200cpm :x X= 10 200/300= 6,6mM X cui nello scomparto 2 in 500cpm ho 16,6mM 14CAg (10mM legate + 6,6mM libero ) Se voglio calcolare la quantità totale di 14CAg (1000cpm) nel primo scomparto 500cpm:16,6mM= 1000cpm:x X= 33,2mM

ELISA due diversi metodi: metodo competitivo Doppio anticorpo

Metodo competitivo si fa reagire: una quantità nota di antigene marcato con un enzima e una quantità ignota dello stesso antigene libero, con uno specifico anticorpo legato ad una fase solida. Si crea competizione tra Ag * ed Ag freddo x legame all’Ab

Dopo aver lavato il complesso con tampone, si aggiunge il substrato dell'enzima e si misura l'attività enzimatica. In condizioni standard, l'attività enzimatica misurata è proporzionale alla frazione di antigene marcato presente nella miscela. un campione in cui si è omesso l'antigene libero rappresenta la misura della concentrazione di Ag incognito.

Schema ELISA competitivo

1 esperimento 2 esperimento Ag+E 10mM, Ag+ E 10mM Ag Conc. incognita Ab su supporto in concentrazione in eccesso Ab su supporto in concentrazione in eccesso Complesso AgE-Ab attività= 1mmole/minuto, Complesso AgE-Ab Complesso Ag-Ab Differenza di attività 1 e 2 esperimento è 0,2 mmol/minuto Proporzione : 0,2mmol/minuto : [Ag]incognita = 1mmol/min.: 10mM AgE Ag incognita= 2mM + S Attività = 0,8 mmoli/minuto

una soluzione ignota di antigene si fa reagire con un anticorpo specifico legato ad una fase solida, si lava e si aggiunge un secondo anticorpo a concentrazione nota e in eccesso; questo anticorpo dovrà essere policlonale per legarsi ad un diverso epitopo dell'antigene secondo lavaggio si aggiunge il substrato dell'enzima. L'attività enzimatica dosata in condizioni standard, saràdirettamente proporzionale alla quantità di antigene presente.

Aspetti pratici ELISA Fasi solide su cui sono immobilizzati gli Ab : microsfere di destrano o poliacrilammide Dischi di carta ( cellulosa) Provette di polipopilene

Immobilizzazione di Ab Adsorbimento passivo Legame covalente mediante bromuro di cianogeno I campioni di Ab sono diluiti con tampone contenente Triton X-100 che serve x evitare legami aspecifici Ab al supporto

E accoppiati a Ag e Ab Fosfatasi alcalina che converte un composto non colorato ( para nitrofenilfosfato in paranitrofenolo (giallo) Perossidasi di rafano che può utilizzare 3 substrati che sviluppano colore verde, arancio, blue

Applicazione ELISA IgG, IgE Ormoni (insulina, estrogeni) Rivelare tossine batteriche ( Candida Albicans, Ag di superficie dell’epatite B, Herpes simplex) Anticorpi contro virus ( Salmonella, ) Anticorpi contro funghi (aspergillus e Candida) Anticorpi contro parassitti ( plasmodium, Trypanosoma) Autoanticorpi (anti-DNA)

Immunodosaggi x bioluminescenza Ag legati alla luciferasi Luciferina + ATP+ O2 ossiluciferina+ AMP+PP+ fotone luciferasi

Metodo competitivo 1 esperimento Ab specifici sono legati ad una fase solida Aggiunta di Ag con luciferasi (Agl) a conc nota (10mM) ed Ag senza luciferasi a conc incognita Sia (Agl) che Ag si legheranno agli Ab Isolamento di Agl Ab da Ag non legato mediante centrifugazione Determinazione dell’attività di luciferasi nel comlesso Agl Ab mediante aggiunta del S (0,5mmoli/min.) 2 esperimento Ag-El 10mM reagisce con Ab si forma AgEL-Ab, si aggiunge S e si determina la attività del complesso (2mmoli/minuto) La differenza tra i complessi del 1 esperimento e del secondo da 1,5mmole/minuto 10mM di AgLAb: 2mmoli/minuto=X Ag: 1,5mM x [Ag]= 7,5 10mM : 2mmoli/minuto=X AglAb: 0,5mM x(AglAb) = 2,5mM

Immunodosaggio mediante il complesso avidina- biotina glicoproteina presente nel bianco dell’uovo (PM 66000Da) -affinità per la biotina (vitamina H): piccola molecola, che può essere facilmente coniugata ad altre proteine (ad esempio Ab), senza alterarne la funzione in questo caso Ag è immobilizzato

Principio Ab marcato con biotina si fa reagire con Ag immobilizzato , Formazione del complesso Ag Ab biotinilato Aggiunge avidina marcata con E Avidina si lega alla biotina del complesso Aggiunge il S e si misura attività E spettrofotometricamente, Attività è direttamente proporzionale alla concentrazione di Ag Luciferina + ATP+ O2 ossiluciferina+ AMP+PP+ fotone luciferasi

Immunoistochimica Per localizzare Ag specifici in sezioni congelate o fissate di tessuti e cellule vitali Ab legato ad un cromoforo fluorescente(fluoresceina, rodamina) Sezioni congelate o fissate di tessuti Il legame Ab Ag Illuminazione con UV il cromoforo emette luce (fluoresceina luce verde, rodamina:luce arancione)