Il genere Bacillus Caratteristiche Bastoncini Sporigeni Gram-positivi. (In cellule vecchie è variabile). Catalasi e ossidasi positivi. Aerobi stretti o aerobi-anaerobi facoltativi. Di solito mobili per ciglia peritriche. Sviluppano bene su terreni nutritivi ordinari. Forme vegetative: pH ottimale tra 6 e 8. Temperatura di crescita: 30-55°C. Tre gruppi in funzione della forma e posizione della spora nel corpo microbico: Spora centrale o sub-terminale, non rigonfia, non deformante il corpo microbico. Spora centrale o sub-terminale, ovale, rigonfia a parete spessa deformante il batterio. Spora terminale, sferica, rigonfia a parete spessa (bacillo a forma di spillo).

Caratteristiche della spora Le endospore di Bacillus sono strutture del batterio che gli consentono di sopravvivere in condizioni ambientali estreme. Le spore hanno uno strato esterno di cheratina che le rende estremamente resistenti al calore, alle radiazioni, alla essiccazione, ai disinfettanti e ad altre sostanze chimiche. Data la loro resistenza sono molto difficili da eliminare rappresentando una importante fonte di contaminazione degli alimenti.

Ciclo di sviluppo di un batterio sporigeno

Bacillus cereus Caratteristiche E’ ampiamente distribuito in natura. E’ un comune ospite del suolo (tellurico), può ritrovarsi nel pulviscolo, nei vegetali, nei materiali fecali animali ed umani. Il suo isolamento nel corso di broncopolmoniti, batteriemie, setticemie, meningiti, infezioni dell'orecchio e delle vie urinarie, lo fa ritenere un patogeno di una certa rilevanza. In particolare, per il ruolo svolto in congiuntiviti acute, iridocicliti purulente, panoftalmie emorragiche, endoftalmiti postraumatiche e metastatiche, anche a carattere fulminante, è considerato uno dei microrganismi più pericolosi per l'organo visivo. Pur essendo mesofilo, è stata dimostrata la possibilità di crescita di ceppi tossinogeni tra 4 e 37°C e tra 6 e 21°C. La germinazione delle spore avviene tra 5 e 50°C, con velocità massima a 30°C.

Bacillus cereus - Caratteristiche

Caratteristiche della malattia Bacillus cereus produce due tipi di malattie: la sindrome diarroica la sindrome emetica.

Sindrome diarroica B. cereus è in grado di produrre nella fase di crescita esponenziale una enterotossina di natura proteica, stabile a 45°C per 10 min, ma inattivabile a 56 °C in 5 min. L'azione enterotossica induce la perdita di liquidi dalla mucosa intestinale. L’enterotossina ingerita con gli alimenti viene di norma distrutta a livello gastrico e/o intestinale e, quindi, difficilmente può determinare intossicazione. Si ritiene, perciò, che l'intossicazione diarroica sia da associarsi prevalentemente all'ingestione di cellule allo stato vegetativo e/o di spore ed alla successiva crescita del bacillo con conseguente produzione di enterotossina a livello dell'ileo. La sindrome diarroica si manifesta generalmente entro 6-15 ore dall'ingestione dell'alimento contaminato (mima l’intossicazione da Clostridium perfringens).

Sindrome emetica B. cereus, durante la sporulazione, produce anche una tossina ad attività emetica, costituita da un piccolo peptide, di peso molecolare inferiore a 5000, stabile a 121 °C per 90 min ed a pH compresi tra 2 e 11, insensibile all'azione di tripsina e pepsina, attualmente ancora non isolata allo stato puro. La sindrome emetica si presenta simile a quella causata da Staphylococcus aureus, con nausea e vomito, e solo di rado dissenteria, che compaiono generalmente entro 2-6 ore, con punte estreme tra i 15 minuti e le 11 ore, e perdurano di solito per 8-24 ore.

Bacillus cereus e alimenti Fonti di contaminazione degli alimenti Spore veicolate dal terreno e la polvere. Latte crudo, pastorizzato, UHT e in polvere; Carne cruda e congelata di bovino, suini e pollame; Prodotti carnei freschi e stagionati; Riso (produzione di tossina emetica); Uova intere, crude e pastorizzate; Prodotti da forno; Spezie; Insalate. Possibilità delle spore di sopravvivere ai trattamenti UHT. Pastorizzazione: insufficiente ad eliminare le spore. Mancata competizione per eliminazione della microflora non sporigena.

Caratteristiche di crescita pH (valori minimi-massimi): tra 4,9 e 9,3 In skim milk a pH 5,5 e a 30°C: tempo di generazione di 45 min. In skim milk a pH 6,5 e a 30°C: tempo di generazione di 26 min. In brodo triptone a pH 4,8 e a 30°C: nessuna crescita. In brodo triptone a pH 5,0 e a 30°C: tempo di generazione di 104 min. Attività dell’acqua 0,95 - in glucosio+estratto di lievito + NaCl: crescita in 72 ore. 0,94 - in glucosio+estratto di lievito + glicerolo: crescita in 24 ore. 0,93 - in glucosio+estratto di lievito + glicerolo : crescita in 72 ore. 0,92 - in glucosio+estratto di lievito + glicerolo : no crescita in dopo 28 giorni.

Bacillus cereus - Ricerca e identificazione NO Bacillus cereus - Ricerca e identificazione NO

Bacillus cereus - Ricerca e identificazione NO Bacillus cereus - Ricerca e identificazione

Il genere Clostridium Caratteristiche Il genere Clostridium è classificato nella Famiglia delle Clostridiaceae: Bastoncini Gram-positivi sporigeni. Mobili per flagelli peritrichi o immobili. Anaerobi stretti e Catalasi negativi. Classificazione semplificata In base alla posizione della spora all’interno dello sporangio e la capacità di liquefare la gelatina: 1. CLOSTRIDI (spore centrali o subterminali) GRUPPO I - glucidolitici non proteolitici GRUPPO II - glucidolitici, poco proteolitici GRUPPO III - glucidolitici e molto proteolitici 2. PLECTRIDI (spora terminale) GRUPPO IV

sui Clostridium botulinici Aggiornamenti sui Clostridium botulinici

Il botulismo è una malattia in comune tra uomini e animali. È causato dall’assorbimento, nell’organismo, di una specifica “neurotossina botulinica” (termolabile: basta la cottura per inattivarla). Si conoscono 5 forme di botulismo umano: “alimentare” (forma classica, tradizionale e più diffusa) “infantile”, “da ferita”, “da inoculazione” (iatrogeno) “da inalazione”. È causato dall’assorbimento in circolo di una quantità minima di neurotossina botulinica (dose tossica: 1 microgrammo/persona).

Nel botulismo alimentare la neurotossina si accumula in un alimento perché un Clostridium neurotossico vi si insedia e riesce a moltiplicare (intossicazione). Nel botulismo infantile un Clostridium neurotossico arriva nell’intestino del neonato, trova condizioni per moltiplicaresi e libera la neurotossina (tossinfezione). Il botulismo da ferita è analogo al tetano: il batterio inquina una ferita, duplica in loco e produce la neurotossina che è assorbita in circolo. Il botulismo da inoculazione (terapeutica o cosmetica) insorge per errori del medico e si manifesta con fenomeni paretico-paralitici a carico dei muscoli mimici (viso). Il botulismo da inalazione è la forma temuta in ipotetici attentati di bioterrorismo. Prevede la dispersione nell’aria della neurotossina già preformata.

Per avere botulismo alimentare, quindi per causare l’accumulo della dose tossica di neurotossina occorre che nell’alimento il batterio superi una carica infettante di almeno 105 ufc/g. In base alle caratteristiche antigeniche, le neurotossine botuliniche si distinguono in A, B, C1, C2, D, E, F, G. Queste neurotossine sono prodotte da più specie di Clostridium per cui non è corretto sostenere che “il botulismo è causato dal solo C. botulinum”. Dato che il botulismo è innescato dalla neurotossina, un Clostridium è botulinico se ha nel suo genoma la sequenza genica che codifica la sintesi della neurotossina.

Importante Lo stimolo nervoso viene dato dall’acetilcolina che si libera. La tossina botulinica impedisce la produzione di acetilcolina e crea il blocco del muscoli e quindi si ha un blocco respiratorio, provocando la morte per soffocamento. La tossina impedisce infatti il passaggio dello stimolo nervoso e determina una paralisi dei muscoli involontari, vedi per primi quelli delle palpebre. Bisogna rispettare le temperature generali, le temperature di sterilizzazione. Quando si moltiplica, il microrganismo produce gas (vedi bombaggio nelle conserve). La cottura distrugge la tossina e determina la sicurezza degli alimenti.

Con l’introduzione degli studi genomici sul DNA di questo gruppo di batteri si sono fatte due importanti scoperte. La sequenza della neurotossina è presente anche nel DNA di altre specie di Clostridium che quindi sono potenzialmente in grado di causare botulismo. Esistono cloni di C. botulinum che viceversa non possiedono la sequenza genica e che, quindi, non sono neurotossici.

I Clostridium botulinici sono suddivisi in 4 gruppi e ciascuno di essi contiene ceppi tossinogeni e non tossinogeni. I gruppo C. botulinum tipo A e ceppi proteolitici di C. botulinum tipi B ed F II gruppo C. botulinum tipo E e ceppi saccarolitici dei tipi B ed F. I ceppi del I gruppo hanno spore molto termoresistenti (almeno 3 minuti a 121°C), non crescono sotto pH 4,5 e a valori di aw inferiori a 0,940. I ceppi del II gruppo hanno spore poco termoresistenti (non più di 5 minuti a 90°C), non crescono sotto pH 4,5 e con aw inferiori a 0,970.

III gruppo Clostridium botulinum tipici degli animali (tipi C e D) IV gruppo Clostridium botulinum tipo G, specie a sé chiamato anche Clostridium argentinense. Individuati con PCR anche ceppi tossinogeni di C. barati, C. sordelli e C. butyricum fenotipicamente e genomicamente differenti da Clostridium botulinum sensu stricto.

Determinante è il fatto che il batterio abbia o meno nel genoma la sequenza che codifica la sintesi della neurotossina (Clostridium botulinico neurotossico) La sequenza genica codificante è stata trovata nel genoma di più specie di Clostridium, ma non in tutti i Clostridium botulinum. La sequenza genica che codifica la sintesi della neurotossina botulinica non si trova sul DNA principale, bensì è posizionata su un plasmide. Per coniugazione, un Clostridium neurotossico può trasmettere questa sua capacità a un Clostridium che fino a quel momento non era neurotossico. Quindi, esistono ceppi di C. botulinum “neurotossici” e altri “non neurotossici”, così come esistono ceppi di altri Clostridium neurotossici (botulinici).

In definitiva, il botulismo è un’intossicazione causata da batteri sporigeni molto anaerobi che sono accomunati dal fatto di potere sintetizzare una pericolosa neurotossina. La prima segnalazione di casi di botulismo provocati da C. butyricum è dei giapponesi Tsukamoto e coll. (2002) Microbial Pathogenesis, 33, 177-184. Casi di botulismo alimentare umano da C. butyricum sono stati segnalati in Cina, da Meng e collaboratori (1999) J. Medical Microbiology, 48, 133-137. Aureli e coll. (1986) hanno descritto in Italia due casi di botulismo infantile da C. butyricum (J. Infectious Dis., 154, 207-211). In Europa e USA è più diffuso il tipo B, il tipo A è diffuso in Sudamerica e Asia. Il tipo E è psicrotrofo e si trova in sedimenti marini e contenuto intestinale di pesci nei paesi dell’emisfero Nord.

I tipi C e D, termotrofi e più esigenti come sostanze nutritive, proliferano nelle carcasse animali delle zone tropicali ed equatoriali. Le neurotossine botuliniche sono relativamente termolabili (oltre 65°C si denaturano in 30’’). Più il pH dell’alimento è acido, più le neurotossine resistono al calore. Più il valore di Aw è basso, più le neurotossine resistono al calore. Non superano la barriera emato-encefalica e agiscono sul sistema nervoso periferico. Per comprendere il meccanismo d’azione delle neurotossine botuliniche (BONTS) bisogna conoscere le basi biochimiche della trasmissione dell’impulso nervoso contrattile.

Il mediatore chimico della trasmissione dell’impulso contrattile è l’acetilcolina, che è contenuta in apposite vescicole, pronte per essere “rotte” nello spazio sinaptico. Sulla membrana della vescicola è agganciata una proteine specifica, la sinaptobrevina. Quando arriva l’impulso nervoso, la sinaptobrevina è “presa sottobraccio” da due proteine presenti sulla membrana assonale, sintassina e SNAP-25.

Il legame induce la rottura delle vescicole nello spazio sinaptico e liberazione di acetilcolina. Le BONTS sono delle sinco-metalloproteasi che legano e inattivano le predette proteine. Secondo il tipo antigenico, ciascuna BONT inattiva una proteina specifica. Le BONTS di Clostridium botulinum A, C ed E legano la SNAP-25.

Le BONTS di C. botulinum B, D, F e G legano la sinaptobrevina 2 (o VAMP 2). Le BONTS sono prodotte dai Clostridium botulinici sottoforma di “pro-tossina”, polipeptidi di circa 150 kDa di peso molecolare. Intestino dell’ospite : BONT scisse in due subunità, una “catena leggera” di 50 kDa e una “catena pesante” di 100 kDa, che restano unite da un legame a ponte disolfuro. Le BONTS sono articolate in tre domini: la metà C-terminale della catena pesante (Hc) con gli specifici recettori presenti sulla superficie dell’assone neuronale. La metà N-terminale della catena pesante (Hn), controlla la penetrazione della tossina attraverso la membrana cellulare del neurone. La catena leggera è quella responsabile dell’effetto tossico perché blocca il rilascio dell’acetilcolina.

Dal 1900 a oggi in Europa i casi di botulismo umano sono sempre 20-30 l’anno per nazione, ma sono cambiate drasticamente le abitudini alimentari. Una volta si consumavano molto conserve e salumi fatti in casa, oggi molto meno. Le fonti di botulismo alimentare oggi sono aumentate e si sono diversificate. Sono più a rischio di botulismo le conserve ad acidità intermedia o poco acide (pH >4,5) di alimenti di origine vegetale e animale, soprattutto conservati sott’olio o sotto strutto. Non sono scevri di pericoli anche prodotti di salumeria e le conserve ittiche (pesci essiccati e poco salati, pesci affumicati). Bisogna riservare particolare attenzione ai REPFED (Refrigerated Processed Foods of Extended Durability), sottoposti a blandi trattamenti di pastorizzazione o cotti in sous-vide, e refrigerati.

Perché si abbia accumulo di una dose sufficiente di neurotossina bisogna che il batterio raggiunga almeno le 105 ufc/g. Il fatto che un Clostridium abbia nel proprio genoma la sequenza che codifica la sintesi di una BONT non significa automaticamente che darà botulismo. Bisogna che il germe duplichi a sufficienza (se l’alimento ne consente la duplicazione) e che riesca effettivamente a sintetizzare la neurotossina. È dimostrato sperimentalmente che l’aggiunta di acido sorbico o sorbati all’alimento è in grado di bloccare la sintesi della BONT. Applicazione delle BPL, conoscenza delle caratteristiche chimico-fisiche dell’alimento e delle condizioni di conservazione sono strategie indispensabili per ridurre il “rischio botulismo”

Clostridium perfringens Caratteristiche Bastoncino sporigeno, Gram-positivo, Catalasi, negativo, Anaerobio stretto (anche se può sopportare concentrazioni di O2 fino al 5%).

Caratteristiche La sporulazione dipende dal substrato nutritivo e dal pH. Le spore sono ovali, centrali o sub-terminali, deformanti lo sporangio. E’ un microrganismo largamente diffuso in natura. La sua grande distribuzione è legata alla dispersione nell’ambiente delle spore e alla loro resistenza a diversi fattori ambientali. Il microrganismo presenta tassi di crescita elevati alla temperatura ottimale di sviluppo (tempi di raddoppiamento di 8-10 min a 45°C). E’ stato ritrovato inoltre nel tratto intestinale di molti animali, compreso l’uomo. I ceppi di Clostridium perfringens sono divisi in 5 tipi: (da A a E) Tipo A: suolo e tratto intestinale di animali; responsabile di avvelenamenti alimentari nell'uomo. Tipo C: sembra poter essere trasmesso per via alimentare, ma solo in zone circoscritte del mondo (es.: Papua Nuova Guinea). Altri tipi: potenziali parassiti intestinali obbligati di vari animali.

Tossinfezione alimentare Causa: dovuta ad una enterotossina prodotta nel corso della sporulazione del microrganismo. Sintomi: dopo 8-12 ore dall'ingestione dell'alimento contaminato con un elevato numero di cellule o spore (106-108); diarrea profusa e forti dolori addominali, raramente accompagnati da febbre, nausea o vomito. Enterotossina: proteina di 34.000 Da, che viene disattivata al calore (60°Cx10 min), da enzimi proteolitici e dagli acidi. Meccanismo: accumulo di liquidi, azione citotossica su cellule VERO. Tossinfezione: principalmente associata al consumo di carne rossa e pollame. La macellazione è un momento quasi inevitabile di contaminazione. Comune fonte della malattia: alimenti non cotti a sufficienza, contaminati da spore termoresistenti e mantenuti alle temperature di crescita del microrganismo per lungo tempo.

Clostridium perfringens e alimenti Caratteristiche di crescita e delle spore Le caratteristiche di termoresistenza variano da ceppo a ceppo: spore più termoresistenti: D90= 15-145 min con z= 9-16 °C spore meno termosensibili: D90= 3-5 min con z= 6-8 °C

Clostridium perfringens Ricerca e identificazione

Considerazioni conclusive I tre microrganismi si caratterizzano per la loro produzione di spore che li rendono molto resistenti ai vari processi tecnologici. Bacillus cereus produce due tipi di malattie: la sindrome diarroica la sindrome emetica. Le neurotossine botuliniche sono tra i più potenti veleni esistenti ed hanno un effetto paralizzante. Sono termolabili. Le spore di Cl. botulinum sono molto resistenti al calore, richiedendo trattamenti di 121°C per 2,5 minuti per eliminarle. Cl. perfringens causa tossinfezioni soprattutto attraverso alimenti non cotti a sufficienza, contaminati da spore termoresistenti e mantenuti alle temperature di crescita del microrganismo per lungo tempo.