La scelta del sistema cellulare coltura primaria cellula immortalizzata linea tumorale

Scelta del sistema cellulare. 2. Efficienza di transfezione 3. Modificazioni post-traduzionali 4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica 5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe) 1. Facilità di coltura e stabilità

Scelta del vettore per ingegneria cellulare

La scelta del vettore Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare: 1.iperespressione proteica 2. espressione regolata per studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo 3. studio della regolazione della espressione di un gene

1.Indagini sulla funzionalità di un gene PROMOTORE STD + GENE D’INTERESSE Scopo della trasfezione PROMOTORE Gene XYZ

2. Studio attività-funzione di una proteina - promotore forte, cellula-specifico + gene per quella proteina 8 Scopo della trasfezione PROMOTORE Gene XYZ

Scopo della trasfezione 3. Controllo dell’espressione genica: indagini sulla regolazione del promotore PROMOTORE DEL GENE DI INTERESSE + GENE REPORTER PROMOTOREREPORTER

Scopo della trasfezione 4. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless Promotore con inserzione + reporter Enhancer + Promotore + reporter Promotore deleto + reporter Promotore + reporter 10

Vettori per ingegneria cellulare  sequenze per la replicazione in procariote  Cassetta di espressione  Polylinker  Promotore (virale, tess. specifico,inducibile, ecc.)  Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione; poliadenilazione; segnali di splicing )  Marcatori di selezione

SV40 origin for episomal replication and simple vector rescue in cell lines expressing the large T antigen (i.e., COS-1 and COS-7)

Transfezione stabile Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione. Marker di selezione: Crescono solo le cellule che hanno acquisito il vettore Creazione di linee stabili

Caratteristiche del gene marker: - deve esprimersi in un’ampia gamma di cellule e tessuti -deve produrre una chiara modificazione del fenotipo - deve distinguersi perfettamente da attività endogene simili - la resistenza endogena al composto selettivo deve essere bassa -deve potersi esprimere a livelli sufficienti per garantire la resistenza -l’enzima prodotto deve inattivare il composto ad alta velocità - i metaboliti liberati dopo la reazione non devono essere tossici.

Geni per markers selettivi: Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro interesse oppure co- trasfettato con un secondo plasmide. timidina chinasi (Tk): enzima che permette la sintesi della timidina. Si selezionano cellule Tk- che vengono poi trasfettate con il plasmide Tk+. In un terreno – timidina crescono solo le cellule che hanno acquisito il plasmide. - sono poche le cellule Tk- e non è detto che vadano bene per il nostro studio asparagina sintetasi xantina-guanina fosforibosil transferasi 27

aminoglicoside fosfotransferasi (Neo): conferisce resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina, neomicina, geneticina…). Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezionare le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfettate  necessario determinare la dose appropriata. igromicina B fosfotransferasi: conferisce resistenza all’igromicina ( Hyg) Hygromycin B is an aminoglycosidic antibiotic that inhibits protein synthesis by disrupting translocation and promoting mistranslation at the 80S ribosome. Resistance to Hygromycin B is conferred by the E. coli hygromycin resistance gene (hyg or hph). Geni per markers selettivi:

Marcatori di selezione per cellule di mammifero Tk fosforila la timidinaAminopterina (Inibisce sintesi timidina-P) Timidina chinasi (Tk) XGPRT sintetizza GMPAcido micofenolico (Inibisce sintesi GMP) Xantina-guanina fosforibosil transferasi (XGPRT) Inattiva Xyl-A 9-  -D-furanosil (Xyl-A) (danneggia DNA) Adenosina deaminasi (ADA) HPH inattiva igromicinaIgromicina B (Inibitore sintesi proteica) Igromicina fosfotransferasi (HPH) Variante resistente DHFRMetotrexate (Inibisce DHFR)Diidrofolato reduttasi (DHFR) APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica) Aminoglicoside fosfotransferasi (APH) MECCANISMO FARMACOENZIMA

Mutanti tk - non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile Timidino chinasi Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio” L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio 5-fosforibosil-1- pirofosfato Uridina monofostato Inosina monofostato Timidina monofostato AMINOPTERINA Guanina monofostato Adenina monofostato Ipoxantina Timidina

RNApolII trascrive anche il sito di poliadenilazione, parte della porzione 3' viene rimossa e l'RNA poliadenilato. Le sequenze downstream devono essere incluse nei vettori di espressione degli eucarioti per avere la sintesi di mRNA Due elementi indispensabili per corretta POLIADENILAZIONE sequenze ricche di GU o U downstream il sito di poliadenilazione; sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate nucleotidi upstream il sito di poliadenilazione Sito di poliadenilazione 35

Reporter : Le cellule con il vettore acquisiscono particolari caratteristiche Funzionalità di un promotore: reporter posto sotto il controllo di quel promotore Funzionalità di un gene: Fusione del gene d’interesse con il gene reporter Entrambi posti sotto la regolazione dello stesso promotore

NON deve avere un’attività proteica SIMILE a quella del gene d’interesse l’attività proteica del Reporter NON deve INTERFERIRE con quelle fisiologiche della cellula: le vie di segnalazione e il metabolismo cellulare devono rimanere integri il saggio sull’attività del reporter deve essere -specifico; -riproducibile -immediato Caratteristiche di un reporter 38

GFP: green fluorescent protein GFP: green fluorescent protein espresso nella medusa Aequorea Victoria in natura produce bioluminescenza dovuta al trasferimento di energia (processo Ca-dipendente associato alla proteina Aeqorina) l’esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza di colore verde in assenza di Ca, Aequorina o qualunque cofattore o substrato mutazioni puntiformi nel cromoforo producono varianti che emettono luce a differente lunghezza d’onda CFP (cyan, colore blu) YFP (yellow, colore giallo) geni reporter 39

ß-galattosidasi: ß-galattosidasi: Codificato dal gene LacZ di E.coli Conversione di alcune sostanze in composti colorati Citochimica : clivaggio del substrato XGal → comparsa di precipitati BLU (colonie blu) Spettroscopia : clivaggio di ONPG (o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside ) → composto solubile giallo geni reporter 41

Vettore PLASMIDE VIRUS (infezione) Promotore: Corte sequenze nucleotidiche Danno inizio alla trascrizione Enhancer: elementi di regolazione positiva Derivati da virus SV40 early gene enhancer: attivo su molti tipi cellulari LTR: long terminal repeat Raus Sarcoma Virus CMV Silencer: elementi di regolazione negativa Fattori per la replicazione : cis, trans MCS 43

Cloramfenicolo acetil-transferasi: Cloramfenicolo acetil-transferasi: Enzima batterico: resistenza all’antibiotico cloramfenicolo Acetilazione del Cloramfenicolo Se si usa come substrato l’antibiotico marcato con C14, viene acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che controlla l’enzima è attivo. Si produce una miscela di molecole marcate rilevate su TLC o autoradiografia Esempio: ANALISI TLC IL Clone A non ha attività acetilasica I Cloni B e C hanno attività acetilasica clone A clone B clone C geni reporter 44

45 Luciferasi: luciferina + ATPluciferil adenilato + PpiATPPpi LUCE luciferil eadenilate + O2ossiluciferina + AMP + LUCEO2AMP

APPLICAZIONI SISTEMI INDUCIBILI SISTEMI INDUCIBILI SILENZIAMENTO GENICOSILENZIAMENTO GENICO 50

permettono di regolare l’espressione di un gene richiedono espressione stabile del gene che si vuole regolare permettono di studiare l’espressione di geni tossici: si possono ottenere linee cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene: - mantenuto “spento” in propagazione - “acceso” al momento dell’esperimento I sistemi inducibili 51

Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tc) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox). Tet-On: l’aggiunta di Tc o Dox accende il nostro gene Tet-Off: l’aggiunta di Tc o Dox mantiene spento il nostro gene Sistemi sfruttano le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline: Tet R= tet repressor protein: regola negativamente l’espressione dei geni coinvolti nella resistenza (trasposone Tn10). In assenza di Tc, Tet R si lega alla sequenza Tet O=tet operator e blocca la trascrizione. Per gli exp in cell di mammifero Tet R è stata modificata: Tet system: TET-ON e TET-OFF 52

53 nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per mantenere lo stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni circa 48 h per reprimere l’espressione del gene X.

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esempio: NSC34-Tet Off 55