The Drug Discovery Process  Program selection (disease)  Drug Target Identification and Target Validation  Lead Compound Identification  Lead Optimization  Preclinical and Clinical Development  Approval and Circulation

Como deve essere un “lead compound”? Sviluppabile  Libertà da vincoli di proprietà intellettuale  Attività biologica significativa in un saggio cellulare  Possibilità di modificazioni chimica: struttura simplice  Elevata affinità per il target (<1mM)  Mancanza di interferenza con gli enzimi P450 o con le proteine de trasporto  Eccellente caratteristiche di DMPK  Complicazione tossicologiche ridotte Druglikeness (regola di Lipinski del 5)  Peso molecolare <500  ClogP <5  Numero di accetoti di legame a H <10  Numero di donatori di legame a H <5  Legami ruotabile <10

 Una volta identificato un nuovo lead, il passo successivo consiste nell’ottimizzare le caratteristiche farmacologiche attraverso opportune modifiche della sua struttura. Gli obiettivi principali del processo di ottimizzazione sono: aumento della potenza, miglioramento della specificità d'azione, riduzione della tossicità e miglioramento delle proprietà farmacocinetiche del lead.  Le modifiche strutturali vengono guidate da criteri di scelta di carattere qualitativo e quantitativo. Il processo di ottimizzazione conclude la fase della ricerca di base ed applicata. Ad esso fanno seguito una serie di operazioni di varia natura che costituiscono la fase di sviluppo preclinico. Lead Optimization

 La elaborazione farmacodinamica consiste nel completamento del quadro del loro profilo di attività;  Per elaborazione farmaco-cinetica si intende la definizione dei dati di assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione de principi attivi ottimizzati;  l'elaborazione tossicologica riguarda la definizione delle loro tossicità acuta, subacuta e cronica.  La elaborazione galenica consiste nell’ elaborazione dei principi attivi in una o più formulazioni. La sperimentazione clinica condotta sull'uomo per confermare le proprietà finora definite negli animali da esperimento si articola in 3 fasi (fasi I-III) che differiscono tra loro per il numero dei soggetti coinvolti, la durata ed il grado di approfondimento della sperimentazione.  Dopo la registrazione e l'introduzione in commercio, il farmaco viene ulteriormente controllato in una fase IV (farmacovigilanza).

Ottimizzazione Lead Ottimizzare le sue caratteristiche farmacologiche  Ottimizzazione delle interazione con il target  Ottimizzazione dell’accesso al target  Farmacodinamica  Farmacocinetica Chimica Farmaceutica

Principi dell’azione di un farmaco Fase farmacodinamica Macromolecole Farmaco Regioni di binding Molecular target Drug Interazione farmaco-bersaglio Recettori Enzime Ormone e fattori Canali ionici

Principi dell’azione di un farmaco Gruppi di binding Farmaco Legame intermolecolare Processo di riconoscimento molecolare  dalle proprietà fisicochimiche come l’interazione ioniche e dipolari  dalle caratteristiche (geometriche) tridimensionali dimensione orientamento stereochimico dei gruppi funzionali

Farmaco e macromolecola possono stabilire i seguenti tipi d’interazione non covalenti:  legame a idrogeno  legame ionico  interazione catione-π  interazione dipolari  trasferimento di carica  interazione idrofobica  interazione sterica Legame intermolecolare

Perché l’interazioni deboli sono importanti?  Sono reversibili. Molecole rigide non faciliterebbero l’attività cellulari  Il riconoscimento molecolare avviene mediante l’interplay di molecole complementari. La funzione biologica viene raggiunta attraverso meccanismi basati sulla complementarietà strutturale e sull’interazioni chimiche deboli  Le strutture possono formarsi spontaneamente e la loro stabilità è ristretta ad un intervallo limitato di condizioni ambientali (temperatura, acidità, forza ionica etc..)  La perdita di struttura (denaturazione) comporta la perdita di funzionalità

Legame a idrogeno  Il legame a idrogeno si instaura tra un gruppo donatore (-OH, -SH, -NH) e un gruppo accettore (=N-, -OH, -O-, =O), cioè tra un idrogeno carente di elettroni, e de un eteroatomo ricco in elettroni  Varia in forza: Più debole di interazioni elettrostatiche, ma più forte di interazioni di van der Waals  L'interazione coinvolge orbitali ed è direzionale

Esempi di accettori forti di legame idrogeno - Ione carbossilato, ione fosfato, ammina terziaria Esempi di moderati accettori di legame idrogeno - Carbossilico, ossigeno ammide, chetone, estere, etere, alcool Esempi di non buoni accettori di legame idrogeno - Zolfo, fluoro, cloro, anello aromatico, ammide azoto, ammina aromatica Esempio di buone donatori di legame idrogeno - Ione ammonio quaternario

Rappresentazione dei legami idrogeni nell’interazioni farmaco- enzime Diaminopimelate epimerase: An antibacterial drug target

Legame ionico  Il più forte dei legami intermolecolari (20-40 kJ mol-1)  Avviene tra gruppi di carica opposta  La forza dell'interazione ionica è inversamente proporzionale alla distanza tra i due gruppi carichi  Interazioni forti si verificano in ambienti idrofobici  La forza di interazione cade meno rapidamente con la distanza rispetto ad altre forme di interazioni intermolecolari  Legami ionici sono i più importanti interazioni iniziali stabilite quando il farmaco entra nel sito di legame

Rimantidine (mistura racemica formulata come idroclorato) Catena laterale del Aspartico (D44) ionizato

Binding site Localised dipole moment Dipole moment R C R O   Binding site R C R O Interazione dipolo-dipolo  Le interazioni dipolari si instaurano tra dipoli  Nelle sostanze organiche i dipoli permanenti sono costituiti da legami covalenti polari (es. O-H, N-H, C=O, C-O, C-Cl, N=O).  Affinché due dipoli si attraggano è necessario che la distanza tra i poli di segno opposto sia maggiore della distanza tra i poli di segno uguale

 Può verificarsi se il farmaco e il sito di legame hanno momenti dipolari  I dipoli s’allineano e il farmaco entra nel sito di legame  L’allineamento del dipolo orienta la molecola nel sito di legame  L’orientamento è vantaggioso se altri gruppi di legame sono posizionate correttamente rispetto alle corrispondenti regioni di binding  L’orientamento non è vantaggioso quando ​​ i gruppi di legame non sono posizionate correttamente rispetto alle corrispondenti regioni obbligatorie  La forza dell'interazione decresce con la distanza più rapidamente che con interazioni elettrostatiche, ma meno rapidamente che con interazioni di van der Waals Interazione dipolo-dipolo

 Si verificano quando interagisce la carica netta su una molecola con il momento di dipolo di un’altra  Sono più forte di una interazione dipolo-dipolo  La forza di interazione diminuisce meno rapidamente con la distanza che per una interazione dipolo-dipolo Binding site   R C R O   R C R O Interazione ion-dipolo

Interazione catione-π : Dipolo indotto  Si verifica quando la carica su una molecola induce un dipolo su un’altra  Consiste nell’attrazione elettrostatica tra un gruppo carico positivamente del farmaco e la nuvola di elettroni π di un anello aromatico del recettore (catena laterale di fenilalanina, tirosina, triptofano, istidina) Binding site RNR 3   

Unstructured water Increase in entropy Drug DRUG Structured water layer round hydrophobic regions Hydrophobic regions regions Water Binding site Drug DRUG Binding  Avviene quando le regioni idrofobiche di un farmaco e il suo bersaglio non vengono solvatati  Molecole d'acqua interagiscono tra loro e formano uno strato ordinato accanto regioni idrofobiche - entropia negativa  Le interazioni tra le interazioni idrofobiche di un farmaco e il suo target “liberano” le molecole d'acqua ordinati  L'intensità dell’interazione idrofobica è proporzionale all’estensione della superficie di contatto poiché essa determina il numero di molecole d’acqua che perdono la loro strutturazione  Si traduce in un aumento di entropia: Vantaggioso per l’energia di legame Interazioni idrofobiche

Interazioni Van der Waals Le forze di Van der Waals sono vere e proprie forze elettrostatiche tra dipoli temporanei ed indotti

Binding site DRUG -- ++  Interazioni molto deboli (2-4 kJmol-1)  Si verifica tra regioni idrofobiche del farmaco e il target  A causa di aree transitorie di densità elettroniche alto e basso portano a dipoli temporanei  Interazioni diminuiscono rapidamente con la distanza  Farmaco deve essere vicino alla regione di legame dove si verifichino interazioni  Il contributo complessivo di interazioni di van der Waals al binding può essere fondamentale ++ -- Hydrophobic regions Transient dipole on drug ++ -- van der Waals interaction Interazioni Van der Waals

Legame di coordinazione ione-metallo  Il legame di coordinazione ione-metallo si realizza tra una funzione acida dissociata (COO -, PO 3 --, -S - ) o un azoto sp 2 (=N-) del farmaco e un catione coordinato nel sito catalitico dell’enzima bersaglio (es. Zn ++, Mg ++, Fe ++ ).  Il MICONAZOLO ed altri farmaci appartenenti alla classe degli azoli antifungini bloccano la sintesi dell’ergosterolo, un componente essenziale della membrana citoplasmatica dei funghi, inibendo l’enzima lanosterolo 14-α-demetilasi.  L’inibizione si basa sulla formazione di un legame di coordinazione tra l’azoto imidazolico del farmaco e il ferro (II) del gruppo eme dell’enzima.

Interazione a trasferimento di carica  La reciproca polarizzazione di due composti con diversa affinità elettronica può provocare il trasferimento di un elettrone da una specie chimica (donatore) all’altra (accettore).  L’interazione "a trasferimento di carica" coinvolge solitamente due anelli aromatici disposti parallelamente a livello degli orbitali π, arrangiamento noto come "π-stacking".  I sostituenti a rilascio elettronico (es. CH 3, OH, OCH 3 ) sull’anello del donatore e i sostituenti a richiamo elettronico sull’anello dell’accettore (es. F, Cl, NO 2 ) favoriscono questo tipo di interazione.

Interazione sterica  L'interazione tra farmaco e target o macromolecola è caratterizzata da una certa adattabilità reciproca dovuta alla flessibilità delle strutture che entrano in contatto.  Tuttavia la flessibilità del sistema non è illimitata. Se la superficie del farmaco non si adatta alla superficie del sito di legame, la forze repulsive di van der Waals possono indebolire o anche impedire la formazione del complesso farmaco-target.  L’energia di van der Waals tra due atomi aumenta con la 12 a potenza della loro distanza ed è alla base dell’interazione sterica repulsiva.

Contributi delle interazioni all’energia di legame Le interazioni attrattive tra farmaco e target sono classificabili sulla base dei valori di ΔG con i quali contribuiscono all’energia di legame (ΔG F-R ):  Legami a idrogeno rinforzati da una o due cariche, legami di coordinazione, i interazioni catione-π: valori di ΔG tra -1,5 e -3 kcal/mole;  Legami a idrogeno semplici, interazioni a trasferimento di carica: valori di ΔG tra -0,5 e -1,5 kcal/mole;  Interazioni idrofobiche: valori di DG tra -0,1 e -1 kcal/mol per ciascun frammento del tipo CH, CH 2, NH, O, S e alogeni. L’intensità di queste interazioni "deboli" cresce con l’aumentare del numero di atomi coinvolti, tanto che un'interazione idrofobica che coinvolge due fenili può essere caratterizzata da un'energia superiore a quella di un legame a idrogeno. In figura: contributo dei valori di ΔG delle singole interazioni all’energia di legame ΔG F-R.