L’attivazione dell’O 2 nelle reazioni di biodegradazione Utilizzo di O 2  Respirazione Piu’ del 90 % dell’ossigeno è consumato dagli organismi nella catena respiratoria O 2 + 4H + + 4e - 2H 2 O E° = V Questa reazione rappresenta la maggiore sorgente di energia negli organismi aerobici, quando accoppiata all’ossidazione di composti organici ricchi di elettroni, come il gluclosio.  Ossigenazione L’ossigeno viene utilizzato per la biosintesi di varie molecole nei pathways metabolici; uno o due atomi di O vengono incorporati nel substrato Monoossigenazione RH + ½ O 2 ROH Diossigenazione Perche’ le reazioni di ossigenazione devono essere catalizzate da enzimi ?

L’attivazione dell’O 2 nelle reazioni di biodegradazione  Potenziali standard di riduzione di O 2 E°, V vs. NHE, pH 7, 25 °C O 2 + e - O (1) O e - + 2H + H 2 O H 2 O 2 + e - + H + H 2 O + OH+0.38 OH + e - + H + H 2 O+2.31 O 2 + 2e - + 2H + H 2 O (2) H 2 O 2 + 2e - + 2H + 2H 2 O O 2 + 4H + + 4e - 2H 2 O O 2 O 2 - H 2 O 2 H 2 O + OH · 2H 2 O La completa riduzione di O 2 richiede 4 elettroni, ma la maggior parte dei riducenti può trasferire 1 o 2 elettroni per volta Aspetti termodinamici della riduzione di O 2 e-e- e -, 2H + e -, H +

L’attivazione dell’O 2 nelle reazioni di biodegradazione La reazione (1), monoelettronica, richiede riducenti molto forti. La reazione (2), bielettronica, è termodicamente più favorita. Le sostanze organiche sono generalmente riducenti deboli per reazioni che coinvolgono 1 elettrone. R · + e - + H +  R-Hpot. rid. elevato La riduzione a 2 e - (reazione 2) è perciò quella termodinamicamente favorita dalle sostanze organiche. Le reazioni a 2 e - sono però reazioni molto lente Aspetti termodinamici della riduzione di O 2

L’attivazione dell’O 2 nelle reazioni di biodegradazione Esempi di reazioni di idrossilazione ed epossidazione di sostanze organiche Queste reazioni sono termodinamicamente permesse tuttavia sono molto lente in assenza di catalizzatori  H (kcal/mol) CH 4 + ½ O 2 CH 3 OH-30 C 6 H 6 + ½ O 2 C 6 H 5 OH-43 C 6 H 5 OH + ½ O 2 CH 4 (OH) C 2 H 4 + ½ O 2 C 2 H 4 O-25 C 5 H 5 N + ½ O 2 C 5 H 5 NO-13 Aspetti termodinamici della riduzione di O 2

L’attivazione dell’O 2 nelle reazioni di biodegradazione Barriera cinetica alla reazione diretta di O 2 con substrati organici O 2 – stato fondamentale: tripletto (2 e - spaiati) RH – stato fondamentale: singoletto (no e - spaiati) ROOH (prodotto) – stato fondamentale: singoletto (no e - spaiati) La reazione può avvenire solo con E att. molto elevata che consenta di portare il prodotto in stato di tripletto O 2 + RHROOH non puo’ avvenire in un unico stadio veloce ma attraverso 2 passaggi successivi con E att alta O 2 + RHROOH ROOH ROOH oppure O 2 potrebbe passare a stato di singoletto O Kcal/mol O 2 O 2 + RHROOH Aspetti cinetici della riduzione di O 2 lenta

L’attivazione dell’O 2 nelle reazioni di biodegradazione L’ossigeno nello stato di tripletto può partecipare a reazioni di ossidazione monoelettroniche di sostanze organiche, senza alterare la molteplicità di spin; tali reazioni sono però termodinamicamente sfavorite O 2 + RHO R · + H + Reazioni bielettroniche sono termodinamicamente favorite, ma violano la molteplicità di spin O 2 + RHROOH Ossidazioni monoelettroniche che coinvolgono uno ione metallico sono favorite e spin permesse O 2 + M n+ M n+1 -O 2 - O 2 + Fe 2+ Fe 3+ -O 2 -

L’attivazione dell’O 2 da parte del ferro in ossigenazioni bielettroniche E’ necessario Fe 2+ Fe 2+ + O 2 Fe 2+ -O 2 Fe 3+ -O 2 -· Fe 3+ -O 2 -· potrebbe essere la specie attiva, invece Fe 3+ -O 2 -· + e - Fe 2+ -O 2 -· Fe 3+ -O 2 2- Fe 3+ -O 2 2- è preferita monoossigenasi diossigenasi

L’attivazione dell’O 2 da parte del ferro in ossigenazioni bielettroniche Fe 3+ -O 2 -· Fe 2+ -O 2 Fe 2+ + O 2 Fe 3+ + O 2 -·  perdita di controllo Fe 3+ -O 2 -· + e - Fe 2+ -O 2 -· Fe 3+ -O 2 2- (1) (2) Un elettrone in più deve essere immediatamente disponibile. Occorrono in totale 2 e - (o almeno devono essere disponibili ad una velocità che sia maggiore delle reazioni 1 e 2) Chi fornisce l’elettrone addizionale? Enzimi idrossilanticentro Fe 2 S 2 MMOFe(II) adiacente Cit P 450 flavoproteina

L’attivazione dell’O 2 da parte del ferro in ossigenazioni bielettroniche Fe 3+ enzimi Fe 2+ enzimi (resting state) (resting state)  cit P 450  diossigenasi  sMMO idrossilanti  Alcano monoossig. (putida monoossina) la riduzione precede sempre ilil ferro è già pronto per legame dell’O 2 legare O 2 Fe 3+ -O 2 2- Specie comune Fe IV =O

Risposta dei microorganismi ai composti xenobiotici  Esempio: degradazione di idrocarburi aromatici e alifatici Ossigenasi  Monoossigenasi RH + O 2 + 2e - + 2H + ROH + H 2 O  Diossigenasi Acido muconico Semialdeide muconica Cis-diidro-diolo

Monoossigenasi RH + O 2 + 2e - + 2H + ROH + H 2 O Enzimi che catalizzano queste reazioni: 1)Metano monoossigenasi (MMO) 2 Fe 3+ non eme 1 Cu-Cu + 1 Cu + 1 Zn(Cu) 2) Citocromo P450 1 Fe 3+ eme 3) Tirosinasi 2 Cu 2+ Per 1) e 2) lo stadio iniziale è la riduzione Fe 3+ + e - Fe 2+ Fe 2+ lega O 2 per dare Fe 3+ -O 2 - Fe 3+ -O e - Fe 3+ -O 2 2-

Monoossigenasi  Le monoossigenasi catalizzano l’inserzione di un atomo di ossigeno nel substrato organico  Il secondo atomo di ossigeno viene ridotto a H 2 O da un riducente esterno (monoossigenasi esterna) S + RH 2 + O 2 SO + H 2 O + R  o dal substrato stesso (monoossigenasi interna) SH 2 + O 2 SO +H 2 O

Metano monoossigenasi  Il metano viene prodotto nell’ambiente come prodotto finale del metabolismo anaerobico di batteri metanogenici  Il metano viene utilizzato da batteri metanotrofici (Methylococcus capsulatus e Methylosinus trichosporium) che ossidano il metano come fonte di carbonio e di energia  Parte del carbonio proveniente dal metano forma la biomassa dei batteri stessi, parte viene eliminato come CO 2.  La reazione di ossidazionedel metano a metanolo necessita di catalizzatori perche’ CH 4 è inerte, con altqa energia di legame (C-H, 104 kcal/mol)  Il passaggio iniziale dell’ossidazione di CH 4, in cui viene rotto il legame C-H, è catalizzato dall’enzima metano monoossigenasi (MMO). CH 4 + O 2 + NAD(P)H + H+CH 3 OH + NAD(P) + H 2 O MMO catalizza l’ossidazione di altri idrocarburi saturi, insaturi, lineari, ramificati e ciclici fino a 8 atomi di C.

Metano monoossigenasi  MMO nei batteri metanotrofi puo’ esistere sia in forma solubile (sMMOH) che insolubile (pMMO) (legata alle membrane).  Tutti i batteri metanotrofici producono la forma insolubile. In condizioni di deficienza di rame molti ceppi batterici producono anche la forma solubile.  L’espressione rame-dipendente delle MMO è regolata a livello di trascrizione.