Cinetica enzimatica A

Specificità degli enzimi Stereochimica Assoluta Di gruppo Di legame V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Specificità degli enzimi Specificità stereochimica V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Specificità degli enzimi Specificità assoluta V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Specificità degli enzimi Specificità di gruppo Proteasi …-Leu-Arg-Gly-Phe-… Taglia qui V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Specificità degli enzimi Specificità di legame Esterasi Estere  Acido + Alcool V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Classificazione degli enzimi Singolo enzima Ureasi Complesso enzimatico Complesso piruvato deidrogenasi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Classificazione gerarchica degli enzimi Ogni enzima viene classificato a secondo della reazione che catalizza. Viene classificato con un numero: EC X.Y.Z.T X = classe Y = sottoclasse Z = sotto-sottoclasse T = numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse http://www.genome.jp/dbget-bin/get_htext?ECtable+-f+T+w+A http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/ V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Classificazione gerarchica degli enzimi 1. Ossidoreduttasi Catalizzano una reazione redox. 2. Transferasi Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una molecola ad un’altra: X-Y + Z  X-Z + Y le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato. 3. Idrolasi Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=O, C-N, C-C, P-O-P,… V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Classificazione gerarchica degli enzimi 4. Liasi Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi dalle Ossidoreduttasi e dalle Idrolasi. 5. Isomerasi Catalizzano modificazioni geometriche. 6. Ligasi (Sintetasi) Catalizzano l’unione di due molecole accoppiata al consumo di ATP o di un altro nucleotide trifosfato. V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Classificazione degli enzimi 1) Ossido-riduttasi 2) Transferasi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica 11

Classificazione degli enzimi 3) Idrolasi 4) Liasi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica 12

Classificazione degli enzimi 5) Isomerasi 6) Ligasi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica 13

Classificazione gerarchica degli enzimi Per esempio: Alcool + NAD+  Aldeide o chetone + NADH Nome comune: alcool deidrogenasi Nome sistematico: alcool:NAD+ ossidoreduttasi EC 1.1.1.1 Numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse La sotto-sottoclasse – con NAD+ o NADP+ come accettori La sottoclasse – Agiscono sul gruppo di donatori CH-OH La classe - Ossidoreduttasi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Isoenzimi Questa classificazione NON riguarda gli enzimi in quanto proteine ma in quanto CATALIZZATORI La classificazione riguarda quindi gli enziomi che catalizzano una reazione. Proteine diverse (con diversa struttura primaria) che catalizzano la stessa reazione, sono ISOENZIMI V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Isoenzimi Sono le forme multiple dovute a differenze, determinate geneticamente, di struttura primaria Sono anche isoenzimi quelle proteine che svolgono la stessa funzione ma sono geneticamente indipendenti, per esempio: EC 1.1.1.37 malato deidrogenasi Citosolica (codificata dal DNA nucleare) Mitocondriale (codificata dal DNA mitocondriale) V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Spontaneità Una qualunque reazione chimica avviene spontaneamente se e solo se la variazione di energia libera (G) è negativa: GT,p < 0 GT = H – TS A T e p costanti V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Gfinale < Giniziale Spontaneità Quindi, data una qualunque reazione chimica A  B Essa avviene spontaneamente se le energie libere molari GB < GA Più in generale qualunque trasformazione avviene se e solo se: Gfinale < Giniziale V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Spontaneità ed equilibrio Quando GB = GA Quindi G = 0 La reazione è all’equilibrio V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Spontaneità e realtà ATP + H2O  ADP + Pi Questo non significa che una reazione chimica (un processo) esoergonica (G < 0) avvenga con velocità apprezzabile. G°’ = -7.3 kcal·mole-1 (-30.6 kJ·mole-1) a pH 7 G° = -10 kcal·mole-1 (-42 kJ·mole-1) a pH 9 ATP + H2O  ADP + Pi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Energia di attivazione In soluzione l’ATP è stabile perché esiste l’energia di attivazione. V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Catalisi In assenza di catalizzatore: A + B  C + D V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Catalisi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Catalisi In presenza di catalizzatore: A + K  AK AK + B  ABK ABK  C + D + K V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Catalisi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Controllo termodinamica e controllo cinetico di una reazione Ogni reazione può avvenire se e solo se è termodinamicamente favorita (G < 0), Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per superare l’energia di attivazione: H202  H2O + ½ O2 Catalizzatore : Nessuno H* = 18 kcal·mole-1 Platino H* = 11.7 kcal·mole-1 Catalasi H* = 5.5 kcal·mole-1 (H* = energia di attivazione) V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Cinetica chimica 27 Velocità di reazione Cinetica chimica Dalle caratteristiche termodinamiche dei reagenti e dei prodotti si può prevedere se una reazione chimica sia realizzabíle e fino a qual punto ( in altre parole se avvenga spontaneamente e quale sia il punto di equilibrio); ma da queste non si può ottenere alcuna informazione circa la sua velocità e il suo meccanismo. Queste informazioni ci vengono dalle misurazioni cinetiche il cui obiettivo è proprio quello di determinare come e con quale velocità le molecole reagiscono tra loro. La disciplina che studia la velocità e il meccanismo delle reazioni chimiche è la cinetica chimica. Velocità di reazione. Consideriamo una generica reazione Questa equazione ci dice che A reagisce con B, dando origine a P e Q. In che modo ci accorgiamo che la reazione "parte e va avanti"? Bisogna dare per scontato che siamo in grado di determinare in qualche modo le quantità di tutti i partecipanti A, B, C e D,in qualsiasi momento: non è spesso molto facile ma qui, per semplicità, lo dobbiamo immaginar e sempre possibile. Ebbene, il fenomeno che all'esterno ci avvisa che le cose cambiano all'interno della soluzione è che le concentrazioni di A e B diminuiscono mentre quelle quelle di P e Q aumentano. Esprimiamo perciò la velocità di un processo chimico in un certo periodo di tempo tramite il rapporto tra la variazione di concentrazione di un reagente o di un prodotto ed il valore di quell' intervallo di tempo. L' espressione matematica della velocità di reazione è la seguente:   dove il segno - indica la variazione negativa della concentrazione dei reagenti. D' altra parte, la velocità di reazione risulta correlata alla concentrazione dei reagenti attraverso l' equazione di velocità: dove k è la costante di velocità ed indica la misura della velocità di reazione quando i reagenti sono in concentrazione unitaria, mentre m ed n sono coefficienti che possono essere pari a zero, numeri interi o frazionari, il cui valore può essere determinato solo sperimentalmente. Ogni coefficiente determina l' ordine di reazione, rispetto al proprio componente, mentre la somma m+n determina l'ordine globale della reazione ,da non confondersi con la molecolarità che rappresenta il numero delle molecole effettivamente coinvolte nella reazione e che urtandosi in modo efficace si trasformano nei prodotti finali. k è la costante di velocità m ed n sono coefficienti che possono essere pari a zero, numeri interi o frazionari, il cui valore può essere determinato solo sperimentalmente Ogni coefficiente determina l' ordine di reazione, rispetto al proprio componente la somma m+n determina l'ordine globale della reazione V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

ordine globale di reazione Cinetica chimica 2 2 1 legge cinetica ordine globale di reazione n m Per calcolare l' ordine globale della reazione si procede nel seguente modo: in una reazione in cui A e B siano gli unici partecipanti, si determina dapprima la velocità di reazione facendo variare A e tenendo fissa la concentrazione di B, e successivamente la velocità di reazione tenedo fisso A e variando la concentrazione di B. Se il risultato sperimentale è quello rappresentato nella figura sottostante, ovvero la velocità di reazione è direttamente proporzionale a [A]2 e a [B], allora la reazione è di secondo ordine rispetto ad A e di primo ordine rispetto a B. V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Cinetica chimica 29 Qual’ è l’ordine globale di reazione? Se sperimentalmente si trova che la velocità di reazione è direttamente proporzionale a [A]2 e a [B] Per calcolare l' ordine globale della reazione si procede nel seguente modo: in una reazione in cui A e B siano gli unici partecipanti, si determina dapprima la velocità di reazione facendo variare A e tenendo fissa la concentrazione di B, e successivamente la velocità di reazione tenedo fisso A e variando la concentrazione di B. Se il risultato sperimentale è quello rappresentato nella figura sottostante, ovvero la velocità di reazione è direttamente proporzionale a [A]2 e a [B], allora la reazione è di secondo ordine rispetto ad A e di primo ordine rispetto a B. La reazione è globalmente di terzo ordine e l' equazione di velocità totale è: v=k [A]2 [B] allora la reazione è di 2° ordine rispetto ad A e di 1° ordine rispetto a B La reazione è globalmente di 3° ordine V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Fattori che influenzano la velocità di reazione Temperatura pH Concentrazione dell’enzima Concentrazione del substrato Nel caso di enzimi allosterici anche la presenza di modulatori positivi e negativi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Temperatura V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

pH V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

[E] V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

[S] Se mettiamo in grafico V in funzione di [S], troviamo che: A bassi valori di [S], la velocità V, aumenta quasi linearmente con l’aumentare di [S]. Ma come [S] aumenta, gli aumenti di V diventano via via più piccoli (iperbole rettangolare). L’asintoto rappresenta la velocità massima della reazione,Vmax La concentrazione di substrato che produce una V che è la metà di Vmax è detta costante di Michaelis-Menten, Km. V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

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Grafico di Michaelis-Menten V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Cinetica enzimatica 1 1913: Michaelis e Menten La prima equazione generale di velocità per una reazione enzimatica fu derivata nel 1903 da Victor Henri. L'equazione di Henri era in grado di spiegare l' osservazione che la velocità iniziale della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'enzima, ma cresce in modo non lineare al crescere della concentrazione del substrato fino ad un valore limite massimo. Gli studi di Henri furono ripresi ed ampliati da Michaelis e Menten (1913) che hanno dato il nome alla equazione generale di velocità di reazioni enzimatiche ad un substrato. La prima assunzione su cui si basa il loro approccio cinetico (assunzione nota come del "quasi equilibrio" o dell"equilibrio rapido") è che il complesso enzima-substrato sia in equilibrio con l'enzima libero e substrato e che questa situazione di equilibrio non sia disturbata dalla formazione del prodotto. In altre parole la velocità di formazione del prodotto a partire da ES è molto piccola rispetto alla velocità con cui ES si scinde a dare E+S ( k3 <<k2 ). V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

In una reazione chimica A  B v = k · [A] V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

In una reazione enzimatica V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

E + S  ES [E]>>[S] Enzima e substrato In una reazione tra enzima (E) e substrato (S), possiamo distinguere tre fasi: Legame tra E e S per formare il complesso ES E + S  ES [E]>>[S] Stato prestazionario Stato stazionario Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Enzima e substrato [S] [P] Concentrazione [ES] [E] Tempo 1a fase Stato Pre-stazionario 2a fase Stato stazionario 3a fase Fine [S] [P] d[P]/dt  cost. Concentrazione [ES] D[ES]/Dt ≈ 0 [E] Tempo V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Enzima e substrato [S] [P] Concentrazione [ES] [E] Tempo 1a fase Stato Pre-stazionario 2a fase Stato stazionario 3a fase Fine [S] [P] d[P]/dt  cost. Concentrazione [ES] D[ES]/Dt ≈ 0 [E] Tempo V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Enzima e substrato In una reazione enzimatica l’ordine di reazione è variabile V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Enzima e substrato In una reazione enzimatica l’ordine di reazione è variabile Ordine 1 Ordine 0 Velocità Velocità [S] [S] V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Trattamento secondo Michaelis e Menten In una reazione enzimatica: Per l’equilibrio veloce (1) INDETERMINABILE INDETERMINABILE k2<<k-1 V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Trattamento secondo Michaelis e Menten Per l’equilibrio veloce (1) [Etot] misurabile [Etot] = [E] + [ES] INDETERMINABILE V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Trattamento secondo Michaelis e Menten Da cui Costante di dissociazione del complesso ES Costante di Michaelis e Menten V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Trattamento secondo Michaelis e Menten La concentrazione del complesso ES Poiché: vdiretta = k2[ES] V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Trattamento secondo Michaelis e Menten Quando tutto Etot diventa ES allora la velocità sarà massima. Vmax = k2[Etot] Quando il substrato satura l’enzima allora la velocità sarà massima V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Equazione di Michaelis e Menten V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Michaelis e Menten Leonor Michaelis (1875-1949) Maud Menten (1879-1960) V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Trattamento secondo Michaelis e Menten Bassa concentrazione (relativamente) di substrato: [S]<<KM (Ordine 1) Alta concentrazione di substrato: [S]>>KM (Ordine 0) V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Trattamento secondo Briggs-Haldane Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di M.M., cambia il significato cinetico di KM Allo stato stazionario: V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Significato di KM KM descrive l’interazione substrato-enzima a livello del sito di legame. KM è, dimensionalmente, una concentrazione: È la concentrazione di substrato al quale la velocità della reazione è metà della Vmax V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Significato di Vmax Vmax è legata a k2 Vmax = k2[Etot] Dipende dalla concentrazione dell’enzima (induzione). V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Vmax/[Etot] = k2 (moli·l-1·s-1)/(moli·l-1) Significato di k2 k2 è una frequenza Vmax/[Etot] = k2 (moli·l-1·s-1)/(moli·l-1) k2 = s-1 Numero di eventi per unità di tempo (numero di turnover). Proprietà cinetica dell’enzima. V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Efficienza catalitica o numero di turnover k2 è detta anche kcat e si ottiene: k2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s-1. ~1 s-1 < k2 < 106 s-1 V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Significato di KM e Vmax V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Enzima Sorgente Substrato Km (mM) n° di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.400 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.500 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.500 1000000 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido aspartico 0.900 Acido a-chetoglutarico 0.100 Acido ossalacetico 0.040 acido glutammico 4.000 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA Chimotripsina Pancreas bovino N-benziltirosinamide 2.500 N-formiltirosinamide 12.000 N-acetiltirosinamide 32.000 gliciltirosinamide 122.000 Creatina fosfochinasi Creatina 19.000 Esochinasi Lievito Glucosio 0.150 Cervello 0.008 Fosfatasi acida Prostata a-glicerofosfato 3.000 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Gliceraldeide-3-fosfato 0.050 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Acido glutammico 0.120 2.000 Ione ammonio 57.000 NAD+ 0.025 NADH 0.018 Xantina ossidasi Latte Xantina 0.030 Acetaldeide 1000.000 V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Enzima Sorgente Substrato Km (mM) n° di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.400 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.500 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.500 1000000 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido aspartico 0.900 Acido a-chetoglutarico 0.100 Acido ossalacetico 0.040 acido glutammico 4.000 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA Chimotripsina Pancreas bovino N-benziltirosinamide 2.500 N-formiltirosinamide 12.000 N-acetiltirosinamide 32.000 gliciltirosinamide 122.000 Creatina fosfochinasi Creatina 19.000 Esochinasi Lievito Glucosio 0.150 Cervello 0.008 Fosfatasi acida Prostata a-glicerofosfato 3.000 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Gliceraldeide-3-fosfato 0.050 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Acido glutammico 0.120 2.000 Ione ammonio 57.000 NAD+ 0.025 NADH 0.018 Xantina ossidasi Latte Xantina 0.030 Acetaldeide 1000.000 V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Enzima Sorgente Substrato Km (mM) n° di turnover (1/s) Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.400 ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014 Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.500 Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.500 1000000 Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale Acido aspartico 0.900 Acido a-chetoglutarico 0.100 Acido ossalacetico 0.040 acido glutammico 4.000 Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA Chimotripsina Pancreas bovino N-benziltirosinamide 2.500 N-formiltirosinamide 12.000 N-acetiltirosinamide 32.000 gliciltirosinamide 122.000 Creatina fosfochinasi Creatina 19.000 Esochinasi Lievito Glucosio 0.150 Cervello 0.008 Fosfatasi acida Prostata a-glicerofosfato 3.000 Fosfogliceraldeide deidrogenasi Gliceraldeide-3-fosfato 0.050 Glutamato deidrogenasi Fegato bovino Acido glutammico 0.120 2.000 Ione ammonio 57.000 NAD+ 0.025 NADH 0.018 Xantina ossidasi Latte Xantina 0.030 Acetaldeide 1000.000 V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Linearizzazione dell’equazione di Michaelis e Menten V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Lineweaver-Burk Inversione V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Lineweaver-Burk 1/v 1/Vmax Pendenza = KM/Vmax -1/KM 1/[S] 1/[S] V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Eadie-Hofstee Trasformazione v/[s] v Vmax/KM Pendenza = - 1/KM Vmax V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Eadie-Hofstee (oppure) Trasformazione Vmax v Pendenza = - KM Vmax/KM v/[s] V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Reazioni enzimatiche con più substrati Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo sequenziale: Prima uno poi l’altro in ordine preciso: Meccanismo sequenziale ordinato Senza un ordine preciso: Meccanismo sequenziale casuale Meccanismo a ping-pong V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Meccanismo sequenziale ordinato V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Meccanismo sequenziale casuale V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Meccanismo a ping-pong V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Meccanismo a ping-pong Così funziona l’esochinasi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Esempio 1) Saccarosio fosforilasi glucosio-fruttosio + fosfato  glucosio-1-fosfato + fruttosio Esperimento di scambio isotopico: glucosio-fruttosio + fruttosio*  glucosio-fruttosio* + fruttosio Il meccanismo è a ping pong 1) Maltosio fosforilasi glucosio-glucosio + fosfato  glucosio-1-fosfato + glucosio Esperimento di scambio isotopico: glucosio-glucosio + glucosio*  glucosio-glucosio + glucosio Il meccanismo è sequenziale V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Es. Meccanismo sequenziale ordinato: reazioni aventi NAD+ e NADH come substrati La lattato deidrogenasi catalizza questa reazione: si lega prima il coenzima che viene anche rilasciato per primo. La sequenza di eventi è ben rappresentata con il sistema sviluppato da W.Wallace Cleland: L’enzima forma sempre un complesso ternario: prima costituito dall’ enzima e dai substrati e dopo la catalisi dall’ enzima e dai prodotti V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Nel meccanismo sequenziale casuale l’ordine con cui i substrati vengono legati e i prodotti rilasciati è casuale La creatina chinasi catalizza questa reazione. Anche in questo caso la sequenza della reazione può essere rappresentata con il sistema di Cleland V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Reazioni a doppio spiazzamento (ping pong) Uno o più prodotti vengono rilasciati prima che tutti i substrati si siano legati all’enzima. La caratteristica di questo tipo di reazione è la presenza di un intermedio costituito dall’enzima modificato. Un classico esempio sono gli scambi di gruppi amminici tra amminoacidi e α-chetoacidi. L’enzima aspartato ammino-transferasi catalizza questa reazione V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

La sequenza degli eventi può essere rappresentata dal seguente sistema: Nel sistema di Cleland i substrati entrano ed escono dall’enzima come una pallina di ping-pong su un tavolo da gioco V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Reazioni enzimatiche con più substrati Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico tenendo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando l’altro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una descrizione del meccanismo: 1/[A] 1/v [B] Sequenziale casuale Ping-pong V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Regolazione dell’attività enzimatica I fattori che regolano l’attività enzimatica sono: Temperatura Enzimi solubili o di membrana pH Effettori Inibitori (inattivatori) Attivatori Effetti allosterici Concentrazione di substrati e prodotti Vie metaboliche Repressione o induzione genica V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Temperatura La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla temperatura. La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura. Denaturazione Aumento cinetico optimum Velocità Temperatura V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Temperatura La temperatura influenza la fluidità di membrana Enzima solubile Enzima di membrana Temperatura di transizione della fase lipidica Ln v Ln v Temperatura alta 1/T Temperatura bassa Temperatura alta 1/T Temperatura bassa V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

pH La stabilità di una proteina dipende dal pH. Alcuni processi coinvolgono valori estremi di pH Pepsina Tripsina Aceticolinesterasi Velocità relativa 2 6 pH 10 V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Effettori Attivatori Inibitori La differenza non è netta, la stessa molecola può funzionare in entrambi i modi a seconda delle condizioni Carica Concentrazione Enzima legato ad altre molecole … V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono l’attività di un enzima, possono dare Inibizione reversibile Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un legame non covalente) l’enzima Inibizione irreversibile Modificano in modo irreversibile l’enzima V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori reversibili A secondo delle loro caratteristiche si definiscono: Inibitori competitivi Inibitori non competitivi Inibitori acompetitivi V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori competitivi Agiscono competendo con il substrato per lo stesso sito di legame, agiscono quindi sulla formazione del complesso ES. L’inibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori competitivi Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori competitivi Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori competitivi SUBSTRATO INIBITORE Sono molecole simili al substrato Occupano lo stesso sito di legame SITO ATTIVO DELL’INZIMA SUBSTRATO ED INIBITORE SI LEGANO ALLO STESSO SITO PRODOTTI IL LEGAME DELL’INIBITORE PREVIENE IL LEGAME DEL SUBSTRATO V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori competitivi Sono molecole simili al substrato Occupano lo stesso sito di legame V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori non competitivi Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame del substrato il quale può comunque legarsi. L’inibizione NON è rimossa aumentando la concentrazione di S V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori non competitivi Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori non competitivi Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori non competitivi INIBITORE SITO ATTIVO DELL’INZIMA Sono molecole diverse dal substrato, si legano ad un proprio sito Ioni metallici (Cu++) Complessanti (EDTA) Modulatori SUBSTRATO SITO INIBITORIO (REGOLATORIO) SUBSTRATO ED INIBITORE SI LEGANO A SITI DIVERSI IN ASSENZA DI INBITORE SI FORMANO I PRODOTTI LA PRESENZA DELL’INIBITORE RIDUCE LA VELOCITÀ DI FORMAZIONE DEL PRODOTTO V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori acompetitivi Agiscono legandosi e bloccando il complesso enzima-substrato. V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori acompetitivi Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori acompetitivi Senza inibitore Con inibitore V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Riassumendo… Inibizione competitiva Inibizione non competitiva Inibizione acompetitiva V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

…riassumendo Tipo di inibizione VMAXapp KMapp Nessuna VMAX KM Competitiva aKM Non competitiva VMAX/a’ aKM /a’ Acompetitiva VMAX /a’ KM /a’ V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori irreversibili Inibitore Formula Origine Meccanismo Ione cianuro CN- Mandorle amare Complessa gli ioni metallici nelle proteine Diisopropil fluorofosfato (DFP) Sintetico Inibisce gli enzimi con serina nel sito attivo Sarin Come il DFP Fisostigmina Frutto del calabar V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Inibitori irreversibili Inibitore Formula Origine Meccanismo Parathion Sintetico Come il DFP (particolarmente attivo su acetilcolinesterasi di insetti) N-tosil-L-fenilalanina clorometil chetone (TPCK) Reagisce con l’His-57 della chimotripsina Penicillina Penicillum Notatum Inibisce gli enzimi della sintesi della parete batterica V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Attivatori Sono molecole che aumentano (o permettono) l’attività enzimatica Protezione dell’enzima Glutatione Ioni metallici Attivazione per azione sulle subunità Azione proteolitica su proenzimi Enzima inattivo + cAMP  Subunità + Subunità catalitica regolatrice V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Procarbossipeptidasi Attivatori Azione proteolitica su proenzimi Tripsinogeno Chimotripsinogeno p-chimotripsina a-chimotripsina + + Enteropeptidasi Tripsina Proelastasi Elastasi + Procarbossipeptidasi Carbossipeptidasi + V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Effetti allosterici Un enzima allosterico è, in genere, un oligomero con subunità correlate. Gli effetti allosterici consistono nel legame di un effettore ad un sito diverso da quello del substrato con conseguente variazione delle proprietà cinetiche dell’enzima. L’effettore può essere lo stesso substrato (effettori omotropici) o diverso (effettori eterotropici). Sito attivo Sito dell’effettore V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Effetto allosterico Un enzima allosterico è un oligomero con subunità correlate la cui attività (Km) viene influenzate dal legame del substrato V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Effetti allosterici Il legame con l’effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato. La velocità dipende da [S] come una sigmoide. n = indice di cooperatività Emoglobina V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Vie metaboliche Una via metabolica è data da un insieme di reazioni catalizzate da enzimi che si susseguono l’una all’altra. Le vie metaboliche sono regolate: Inibizione da prodotto Attivazione da substrato V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Vie metaboliche ramificate Inibizione multivalente Inibizione cooperativa V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Vie metaboliche ramificate Inibizione cumulativa Inibizione di enzimi multipli V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Catabolismo e anabolismo V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica

Regolazione genica Un’altra via con la quale viene regolata l’attività di uno o più enzimi è attraverso l’induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica. Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi. V.1.3 © gsartor 2001-2008 Cinetica enzimatica