Spettrofotometria

La spettrofotometria La spettrofotometria si occupa dello studio quali-quantitativo delle radiazioni assorbite (o emesse) dalla materia (atomi, molecole, cristalli) in particolari condizioni

Assorbimento ed emissione Se, quando una radiazione elettromagnetica attraversa un mezzo, si può osservare un indebolimento della sua intensità si parla di “assorbimento” Quando un materiale irradia l’energia che gli viene fornita attraverso un opportuno sistema, si parla di “emissione” (es. lampade per illuminazione)

Le molecole che assorbono energia passano da: stato fondamentale stato eccitato Assorbimento ed emissione non interessano quasi mai una singola radiazione ma si esplicano contemporaneamente in diverse regioni dello spettro elettromagnetico Il complesso delle radiazioni assorbite o emesse da un materiale ne costituisce il cosiddetto “spettro di assorbimento” o di “emissione”

In un grafico intensità / frequenza (o lunghezza d’onda ) lo spettro può essere discontinuo (a righe ) oppure continuo (a bande) Le radiazioni elettromagnetiche sono state usate per studiare la struttura delle molecole

Lo spettro elettromagnetico Raggi  Raggi X UV IR microonde onde radio Lunghezze d’onda (  ) alte, frequenze basse, energie basse Lunghezze d’onda (  ) basse, frequenze alte, energie alte vis

L’ultravioletto (U.V.) 400 nm200 nm Bassa frequenza Bassa energia Alta frequenza Alta energia Lunghezza d’onda L’assorbimento della radiazione U.V. riguarda gli elettroni della molecola, che passano da un orbitale di legame ad uno a più alta energia (non occupato di non legame o di antilegame) U.V. A: Proprietà abbronzanti U.V.B: Vit. D U.V. C: Proprietà germicide

Il visibile (vis) 750 nm 400 nm Bassa frequenza Bassa energia Alta frequenza Alta energia Lunghezza d’onda

L’infrarosso Le molecole assorbono le radiazioni infrarosse (IR) comprese tra 3 e 25 μ L’assorbimento è determinato dalle vibrazioni molecolari dei singoli legami o di particolari gruppi di atomi

Le microonde Le molecole assorbono radiazioni anche nel campo delle microonde, tra 3 mm e 3 cm come conseguenza delle rotazioni molecolari

La spettrofotometria UV-Vis In questo tipo di spettrofotometria l’assorbimento di energia permette il passaggio di un elettrone da uno stato fondamentale ad uno stato eccitato Gli elettroni coinvolti sono quelli dei legami  perciò i composti che presentano uno spettro UV-Vis sono quelli che contengono doppi legami Man mano che aumenta il numero dei doppi legami (coniugati, cioè alternati con legami semplici) l’assorbimento si sposta a lunghezze d’onda più elevate (da UV a Vis)

Come si registra uno spettro UV-Vis Si prepara una soluzione, in genere molto diluita, in un solvente che non assorba tra 200 e 750 nm (H 2 O, esano, etanolo….) Si pone la soluzione in una cella di quarzo (se si registra un UV) oppure di vetro (se si registra nel campo del Vis - il vetro non lascia passare radiazioni di lunghezza d’onda < 350 nm) che viene chiamata “cuvetta” Si pone la cella in uno spettrofotometro, dove verrà attraversata dalla radiazione Si registra lo spettro della radiazione dopo il passaggio attraverso la soluzione

Come è fatta una cuvetta Cuvetta capillare Cuvette

Lo spettrofotometro UV-Visibile

Come è fatto uno spettrofotometro assorbanza campione prisma sorgente di luce lente analizzatore

Come funziona uno spettrofotometro

I colori complementari Se una molecola assorbe l’arancione, si vede blu

Utilizzo dello spettrofotometro UV-Vis Si può utilizzare per: determinare la concentrazione di soluzioni contenenti molecole conosciute riconoscere un prodotto noto dal suo spettro caratterizzare un prodotto sconosciuto determinare altre caratteristiche di un prodotto dipendenti dalla concentrazione …..

Leggi dell’assorbimento della radiazione U.V. Legge di Lambert: la frazione di luce assorbita non dipende dall’intensità della sorgente Legge di Beer: l’assorbimento è proporzionale al numero delle molecole che assorbono Il logaritmo del rapporto tra l’intensità relativa della luce incidente e l’intensità relativa della luce trasmessa viene chiamato “assorbanza” (A)

Legge di Lambert-Beer Mette in relazione l’assorbanza di una soluzione con la concentrazione della specie che assorbe ad una certa lunghezza d’onda A = .l.c A = assorbanza  = coefficiente di estinzione molare (caratteristica del composto analizzato, in pratica valore dell’assorbanza quando l = 1 e c = 1) l = spessore della cella di misura, in cm ( nel nostro caso lo spessore della cuvetta è di 1 cm ) c = concentrazione della soluzione in moli / L

Come utilizzare la legge di Lambert-Beer Se l’incognita è la concentrazione c: la lunghezza della cella l è nota l’assorbanza A si misura il coefficiente di estinzione molare  deve essere noto in letteratura se non si dispone del valore di  si può ricavarlo tramite misure di soluzioni a concentrazione nota (retta di taratura)

Esempi di spettri

Esempio di utilizzo della spettrofotometria UV-Vis Si vuole determinare quanta vitamina A (P.M. = 286 g / mole )è presente in un campione da analizzare Si pesano g ( 10 mg ) di campione, si sciolgono in 100,00 mL di esano e si registra lo spettro UV-Vis A 325 nm ( del massimo dell’assorbimento nel caso della vitamina A ) il campione ha un’assorbanza A = 0.68 Sapendo che la  della vitamina A ha un valore di 50000, si può calcolarne la quantità presente nel campione

A =  l c 0.68 = c c = 0.68 / = moli / L moli / L = mmoli / mL mmoli/mL. 100 mL = mmoli di vitamina A mmoli. 286 mg / mmole (P.M. della vitamina A)= mg di vitamina A nel campione

Retta di taratura Abs = 0.015[S][S] = Abs / 0.015; Abs = 087 -> [S] = 58 mM Esempio utilizzo retta di taratura