PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI La misura della quantità di analita (An) è basata sulla competizione con il tracciante (An*) per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). L’equilibrio che si instaura è: KAn An + Ab An-Ab Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*]i = costante [Ab]i = costante [Ab]i < [An]i + [An*]i + An* KAn* An*-Ab

ELISA understanding the acronym EL Enzyme-Linked An enzyme’s activity is used as a “reporter” to test for the presence/amount of a protein of interest. The enzymatic reaction will produce a colored species.

ELISA understanding the acronym EL Enzyme-linked IS Immunosorbent An antibody or antigen (“immuno”) is adsorbed (“sorbent”) onto the polystyrene wells in which we conduct the test. One antibody is already adsorbed added to the wells and a second antibody with our enzyme will be added in the type of ELISA we will perform today.

ELISA understanding the acronym EL Enzyme-linked IS Immunosorbent A Assay We will could determine the amount of (quantitative assay). We will use concentration standards to construct a standard curve.

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

384 wells 1536 wells

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTO Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione SATURAZIONE Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI COMPETITIVI ETEROGENEI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Antigene Enzima Incubazione Tracciante Anticorpo di rivelazione Aggiunta del tracciante Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” SATURAZIONE Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO SU FASE SOLIDA “SANDWICH” Aggiunta del campione Incubazione Aggiunta del tracciante Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH) DIRETTI INDIRETTI

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO + + Ab anti-ferritina marcato con HRP Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo 60 min 37 °C + 30 min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione

Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO CARATTERISTICHE DEL METODO Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Anticorpo Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Anticorpo specie-specifico Incubazione Substrato enzimatico Lavaggio Antigene di cattura immobilizzato Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Saturazione Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

STRATEGIE DI RIVELAZIONE DI UN ANTICORPO Marcatura diretta Ab anti-specie X marcato Rivelazione mediante un anticorpo secondario marcato Ab ottenuto nella specie X Streptavidina marcata Ab anti-specie X biotinilato Rivelazione mediante un anticorpo secondario rivelabile con un opportuno reagente Ab ottenuto nella specie X

COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA IMMUNODOSAGGI MEDIANTE IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA biotina avidina enzima MARCATURA CON IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA TECNICA DEL PONTE AVIDINA-BIOTINA

POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay Negativo Positivo Permettono un’analisi qualitativa o semi-quantitativa molto rapida: Il campione viene aggiunto ad una estremità (S) e fluisce lungo la membrana per effetto di capillarità, Successivamente, si raggiunge la zona di cattura dell’analita (T) e la zona di controllo (C)

LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura:    - da negativo a 20 mg/l    - da 20 a 50 mg/l    - da 50 a 100 mg/l    - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test:    - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l    - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l    - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l    - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza:    - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante    - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO 9002 Conformità direttiva 98/79/CEE