Affinità, efficacia, e potenza Identificazione di un saggio biologico Affinità, efficacia, e potenza Una volta che una nuova molecola è stata sintetizzata, si deve verificare che possiede l'attività funzionale e l'efficacia terapeutica prevista attraverso la valutazione delle loro proprietà in una sequenza ordinata logica di test: Architettura di screening

Identificazione di un saggio biologico High throughput screening (HTS) HTS comporta la miniaturizzazione e l'automazione di test in vitro tali che un gran numero di analisi può essere effettuata in un breve periodo di tempo. Esso comporta sperimentazione di gran numero di composti contro un gran numero di bersagli. Il test dovrebbe produrre effetti facilmente misurabile. Questo effetto può essere la crescita cellulare, una reazione enzimatica che produce un cambiamento di colore (può essere un colorante), o lo spostamento d’un ligando marcato (radioattivo) dai suoi recettori.

Screening ad alta portata (HTS) Principi di tre saggi usati per lo screening (saggi attività chinasica) This figure outlines the principles behind three assay types used for screening. The examples illustrate their application to kinase assays, but in all cases the methods are applicable to other target types . A standard separation-based assay is depicted in a, in which radiolabelled ATP transfers a labelled phosphate moiety from ATP to substrate. The substrate is subsequently captured on a membrane, and separated from the ATP substrate by filtration. The signal is measured by addition of scintillate and quantitated by counting. SEPARATION-BASED ASSAY 3

Screening ad alta portata (HTS) FRET ASSAY This figure outlines the general principles of FRET, a homogeneous assay format. In this case, a labelled substrate is phosphorylated allowing it to bind to a second molecule labelled with an acceptor group. The proximity of the two groups allows energy transfer between the donor and acceptor. This causes a shift in wavelength for the signal emitted from the assay and detection of the product without separation from the substrate. FRET = three-fluorophore fluorescence resonance energy transfer 4

Screening ad alta portata (HTS) ADP assay * Another homogeneous assay format in which the conversion of ATP to ADP is coupled to the conversion of NADH to NAD+ using two enzymes, pyruvate kinase (PK) and lactate dehydrogenase (LD). This decreases the A340 of the assay, which is used to monitor the progress * luminescence-based ADP detection 5

Nuclear Magnetic Resonance SCREENING NMR Nuclear Magnetic Resonance L’NMR è stato utilizzato come strumento per la determinazione delle strutture molecolari dei composti. Nella spettroscopia NMR, il composto vengono irradiati con un breve impulso di energia che eccita i nuclei degli specifici atomi (H, N, C), in seguito, i nuclei eccitati lentamente si rilassano e torna allo stato fondamentale emettendo energia. Figure 1. Principle of NMR reporter screening. In this experiment, the resonance signals of a reporter ligand (triangles) are detected in the presence of the target protein and test compounds in 1D proton spectra. (a) Without protein target, the signals of the reporter ligand are sharp, as commonly observed for small, unbound molecules. (b) In the presence of the target protein but in the absence of test compounds, the reporter ligand is bound to the target protein with moderate affinity, and its relaxation rate is increased, as evidenced by the severe line broadening of the reporter ligand resonances in the NMR spectrum. (c) After adding test compounds that bind to the same site as the reporter ligand with higher affinity, the reporter ligand is displaced from the binding site, so that it becomes unbound. Unbound reporter ligand can be readily distinguished from bound reporter ligand by its sharp resonances in the NMR spectrum (peaks colored blue, compare with spectrum in (a)). If test compounds are added that do not bind to the protein target, bind more weakly than the reporter ligand, or bind to a different, non-competitive binding site, the test compounds would not displace the reporter ligand from its binding site, and therefore it would remain bound to the target. This would be manifested by broad lines in the NMR spectrum of the reporter ligand, as seen here in (b). Esistono, diversi vantaggi nell'utilizzo NMR come un sistema di rivelazione: 1-E 'possibile schermare 1000 composti con piccolo peso molecolare in un giorno con una sola macchina. 2-Il metodo può determinare legami deboli che non verrannorilevati per lo metodi di screening convenzionali. 3-Può identificare il legame di piccole molecole alle diverse regioni del sito di legame. 4-E 'complementare al sistema HTS. Il secondo tempo, può dare risultati falsamente positivi, ma questi possono essere controllati da NMR per garantire che i composti in questione sono vincolanti nel sito di legame corretto.

SCREENING NMR Nuclear Magnetic Resonance NMR assay Figure 1. Principle of NMR reporter screening. In this experiment, the resonance signals of a reporter ligand (triangles) are detected in the presence of the target protein and test compounds in 1D proton spectra. (a) Without protein target, the signals of the reporter ligand are sharp, as commonly observed for small, unbound molecules. (b) In the presence of the target protein but in the absence of test compounds, the reporter ligand is bound to the target protein with moderate affinity, and its relaxation rate is increased, as evidenced by the severe line broadening of the reporter ligand resonances in the NMR spectrum. (c) After adding test compounds that bind to the same site as the reporter ligand with higher affinity, the reporter ligand is displaced from the binding site, so that it becomes unbound. Unbound reporter ligand can be readily distinguished from bound reporter ligand by its sharp resonances in the NMR spectrum (peaks colored blue, compare with spectrum in (a)). If test compounds are added that do not bind to the protein target, bind more weakly than the reporter ligand, or bind to a different, non-competitive binding site, the test compounds would not displace the reporter ligand from its binding site, and therefore it would remain bound to the target. This would be manifested by broad lines in the NMR spectrum of the reporter ligand, as seen here in (b).

SCREENING SLAPSTIC Assay Figure 2. Principle of the SLAPSTIC experiment. Small, unbound organic compounds in solution have typically sharp resonances (spectrum at the top). When they bind to a paramagnetic spin-labeled protein target, their signal intensity is drastically reduced or completely quenched by paramagnetic relaxation enhancement (spectrum at the bottom).

3-FABS method Figure 3. Schematic diagram showing the principle of the 3-FABS method. First, a fluorine-containing moiety, like CF3, is introduced in the substrate as a “sensor” or reporter group. The chemical modification of the substrate by the enzyme (here represented as addition of a chemical fragment denoted “A”) induces changes in the electronic cloud of the CF3 moiety. This results in distinct chemical shifts for the product and the substrate 19F signals, and therefore chemical shift changes in the 19F NMR spectra (bottom).

Protocollo per il rapido screeneng de piccole molecole che consente determinare la loro capacità de legare una proteina target ottenendo informazione strutturale La metodologia coinvolge tecniche di cromatografia d’esclusione (dimensione) su gel, spettrometria di massa (MS) e NMR L’Hits identificati dono assaggiati individualmente per la perturbazione dei chemical shift in un esperimento 2D 1H-15N-HSQCNMR verificando interazione specifiche dei composti con le proteine e identificando i siti di binding sulla proteina is a protocol for rapidly screening small organic molecules for their ability to bind a target protein while obtaining structure related information as part of a structure based drug discovery and design program. The methodology takes advantage of and combines the inherent strengths of size-exclusion gel chromatography, mass spectrometry and NMR to identify bound complexes in a relatively universal high-throughput screening approach. Size-exclusion gel chromatography in the spin column format provides the high-speed separation of a protein-ligand complex from free ligands. The spin column eluent is then analyzed under denaturing conditions by electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) for the presence of small molecular-weight compounds formerly bound to the protein. Hits identified by MS are then individually assayed by chemical shift perturbations in a 2D 1H-15N-HSQC NMR spectrum to verify specific interactions of the compound with the protein and identification of the binding site on the protein. Protocollo per il rapido screeneng de piccole molecole che consente determinare la loro capacità de legare una proteina target ottenendo informazione strutturale dentro d’un programma di disegno basato nella struttura di nuovi farmaci La metodologia coinvolge tecniche di cromatografiad’esclusione (dimensione), su gel spettrometria di massa (MS) e NMR nella individuazione di complessi legami con un approccio di hts La cromatografia de esclusione su gel asicura una rapida separazione del complesso proteina-ligando dei ligandi liberi Le frazione eluita delle colomna sono posteriormente analizzata sotto condizioni denaturante con metodiche di ionizzazione elettrospray in spettrometria massa la presenza di composti di basso peso molecolare legati formalmente alla proteina Queste Hits identificati dono assaggiati individualmente per la perturbazione dei chemical shift in un esperimento 2D 1H-15N-HSQC NMR verificando interazione specifiche dei composti con le peroteine e identificare i siti di binding sulla proteina

SCREENING NMR

Nuclear Magnetic Resonance SCREENING NMR Nuclear Magnetic Resonance Esistono, diversi vantaggi nell'utilizzo della NMR come sistema di rivelazione: E 'possibile schermare 1000 composti con piccolo peso molecolare in un giorno con una sola macchina. Il metodo può determinare legami deboli che non verranno rilevati per lo metodi di screening convenzionali. Può identificare il legame di piccole molecole alle diverse regioni del sito di legame. E 'complementare al sistema HTS. Queste ultimo, può dare risultati falsamente positivi, ma possono essere controllati da NMR per garantire che i composti in questione sono vincolanti nel sito di legame corretto. L'identificazione di molecole leganti deboli consente la possibilità di utilizzare queste come building blocks per la costruzione di molecole più grandi che legano più fortemente. Lo screening può essere fatto su una nuova proteina, senza bisogno di conoscere la sua funzione. Lo screening NMR ha anche dei limiti, il principale è che almeno 200 mg di proteina necessaria.

Surface Plasmon Resonance SCREENING Surface Plasmon Resonance BIOSENSORI BIOSENSORI Definizione IUPAC: "un biosensore è un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive, o tessuti, o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi l'informazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi, in un segnale utile analiticamente. L'interazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) è alla base del corretto funzionamento di un biosensore". I biosensori rilevano interazioni fra (macro)molecole biologiche Ciò è possibile grazie all'utilizzo di macromolecole di origine biologica (molecola immobilizzata di riconoscimento, specie gialla Fig.1) integrate in un sistema di trasduzione del segnale fisico. Questo segnale deriva dall'interazione specifica fra la specie ricercata (analita target, molecola rossa Fig.1) e l'elemento sensibile stesso. Le interazioni biomolecolari possono essere monitorate direttamente utilizzando il cosiddetto "sensore a campo evanescente". Questa tecnica si basa sul fenomeno ottico della risonanza plasmonica supeficiale (SPR).

La formazione di un complesso proteina-ligando modifica le proprietà dell'onda evanenescente, o in altre parole modificherà l'indice di rifrazione del mezzo. La derivante variazione dell'angolo di risonanza, Qsp, è direttamente proporzionale alla quantità di ligando legato alla macromolecola Lo strumento IAsys, un biosensore a guide d'onda per lo studio di interazioni biomolecolari, permette il costante controllo delle reazioni, così da consentire lo studio della dinamica e della forza di legame. L'analisi viene condotta rapidamente utilizzando ridotte quantità di materiale e senza la necessità di marker o di step di purificazione. Anche l'IAsys è basata sul fenomeno ottico del campo evanescente. Questo fenomeno si manifesta quando la luce subisce una riflessione interna totale (TIR) e ne risulta incrementata nell'intensità per passaggio attraverso una struttura a guida d'onda, chiamata specchio di risonanza (Fig. 4): ciò è dovuto alla formazione di una cavità di risonanza (o guida d'onda) ed ad una quasi completa riflessione della luce. Nella TIR, per angoli superiori all'angolo critico, le onde luminose sono completamente riflesse. Il campo elettrico, ad ogni modo, non si estingue in maniera discontinua e penetra approssimativamente per una lunghezza d'onda nel mezzo a basso indice di rifrazione, decadendo esponenzialmente. Questo campo è denominato campo evanescente e la sua intensità aumenta con l'angolo di risonanza del biosensore. Questo angolo di risonanza è altamente sensibile all'indice di rifrazione della superficie. L'utilizzo del campo evanescente per esaminare l'indice di rifrazione conferisce una selettività di superficie al sensore, e non saranno rilevati cambiamenti che avvengano al di fuori della superficie stessa. In tal modo, mediante immobilizzazione del ligando sulla superficie del sensore, è possibile effettuare esclusivamente misure su quelle molecole (ligato) che si legano o che si dissociano dal ligando. Lo specchio di risonanza è una struttura semplice, costituita da due strati dielettrici su vetro, che permettono prestazioni elevate e riproducibili. Il dispositivo consiste in una guida d'onda ed in un prisma, entrambi ad alto indice, separati da uno strato di collegamento interposto a basso indice. Un raggio laser (λ =670 nm) sonda per un angolo di 10° intorno al dispositivo. Raggiunto l'angolo di risonanza, la luce di alta intensità passa dal prisma, attraversa lo strato di collegamento, per propagarsi poi nella guida d'onda come onda evanescente superficiale. Il processo di attraversamento è reversibile, il che permette la fuoriuscita di parte della luce. La luce quindi torna indietro attraverso lo strato di collegamento, per poi raggiungere il detector. Per una corretta risoluzione dell'angolo di risonanza, i componenti della struttura ottica sono disposti in modo da ottenere una rotazione della polarizzazione di 90°. Viene utilizzato un sistema di rivelazione in fase, al fine di isolare esclusivamente la componete della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza. Un polarizzatore, collocato davanti al detector, permette un'accurata distinzione dell'angolo in esame; tale dispositivo è estremamente sensibile al campo evanescente della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza, che è indice delle reazioni di formazione o scissione di legami sulla superficie del sensore. L'intensità del campo evanescente decade esponenzialmente, e dopo 100 nm è ridotta ad un terzo della sua intensità. Tale andamento assicura che vengano analizzate esclusivamente le interazioni delle specie immobilizzate. Qualsiasi materiale che dal campione entri all'interno del campo evanescente, provocherà un'alterazione del profilo dell'indice di rifrazione nelle vicinanze della superficie del dispositivo, cambiando così l'angolo di risonanza. Il cambiamento nella posizione del picco di intensità può essere seguito accuratamente, intervallando i campionamenti fino a tre al secondo.

Il lettore ottico del biosensore misura lo spostamento dell'angolo SPR e la risposta dipende anche dall'indice di rifrazione del volume della soluzione in prossimità del film metallico. I dati grezzi sono presentati in tempo reale in un grafico (sensorgramma) su computer collegato al biosensore, in unità di risposta (arcsec nel caso dell'Iasys), cioè variazione dell'angolo di risonanza in funzione tempo) Lo strumento IAsys, un biosensore a guide d'onda per lo studio di interazioni biomolecolari, permette il costante controllo delle reazioni, così da consentire lo studio della dinamica e della forza di legame. L'analisi viene condotta rapidamente utilizzando ridotte quantità di materiale e senza la necessità di marker o di step di purificazione. Anche l'IAsys è basata sul fenomeno ottico del campo evanescente. Questo fenomeno si manifesta quando la luce subisce una riflessione interna totale (TIR) e ne risulta incrementata nell'intensità per passaggio attraverso una struttura a guida d'onda, chiamata specchio di risonanza (Fig. 4): ciò è dovuto alla formazione di una cavità di risonanza (o guida d'onda) ed ad una quasi completa riflessione della luce. Nella TIR, per angoli superiori all'angolo critico, le onde luminose sono completamente riflesse. Il campo elettrico, ad ogni modo, non si estingue in maniera discontinua e penetra approssimativamente per una lunghezza d'onda nel mezzo a basso indice di rifrazione, decadendo esponenzialmente. Questo campo è denominato campo evanescente e la sua intensità aumenta con l'angolo di risonanza del biosensore. Questo angolo di risonanza è altamente sensibile all'indice di rifrazione della superficie. L'utilizzo del campo evanescente per esaminare l'indice di rifrazione conferisce una selettività di superficie al sensore, e non saranno rilevati cambiamenti che avvengano al di fuori della superficie stessa. In tal modo, mediante immobilizzazione del ligando sulla superficie del sensore, è possibile effettuare esclusivamente misure su quelle molecole (ligato) che si legano o che si dissociano dal ligando. Lo specchio di risonanza è una struttura semplice, costituita da due strati dielettrici su vetro, che permettono prestazioni elevate e riproducibili. Il dispositivo consiste in una guida d'onda ed in un prisma, entrambi ad alto indice, separati da uno strato di collegamento interposto a basso indice. Un raggio laser (λ =670 nm) sonda per un angolo di 10° intorno al dispositivo. Raggiunto l'angolo di risonanza, la luce di alta intensità passa dal prisma, attraversa lo strato di collegamento, per propagarsi poi nella guida d'onda come onda evanescente superficiale. Il processo di attraversamento è reversibile, il che permette la fuoriuscita di parte della luce. La luce quindi torna indietro attraverso lo strato di collegamento, per poi raggiungere il detector. Per una corretta risoluzione dell'angolo di risonanza, i componenti della struttura ottica sono disposti in modo da ottenere una rotazione della polarizzazione di 90°. Viene utilizzato un sistema di rivelazione in fase, al fine di isolare esclusivamente la componete della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza. Un polarizzatore, collocato davanti al detector, permette un'accurata distinzione dell'angolo in esame; tale dispositivo è estremamente sensibile al campo evanescente della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza, che è indice delle reazioni di formazione o scissione di legami sulla superficie del sensore. L'intensità del campo evanescente decade esponenzialmente, e dopo 100 nm è ridotta ad un terzo della sua intensità. Tale andamento assicura che vengano analizzate esclusivamente le interazioni delle specie immobilizzate. Qualsiasi materiale che dal campione entri all'interno del campo evanescente, provocherà un'alterazione del profilo dell'indice di rifrazione nelle vicinanze della superficie del dispositivo, cambiando così l'angolo di risonanza. Il cambiamento nella posizione del picco di intensità può essere seguito accuratamente, intervallando i campionamenti fino a tre al secondo.

Dal sensogramma è possibile derivare un insieme di conclusioni: Lo strumento IAsys, un biosensore a guide d'onda per lo studio di interazioni biomolecolari, permette il costante controllo delle reazioni, così da consentire lo studio della dinamica e della forza di legame. L'analisi viene condotta rapidamente utilizzando ridotte quantità di materiale e senza la necessità di marker o di step di purificazione. Anche l'IAsys è basata sul fenomeno ottico del campo evanescente. Questo fenomeno si manifesta quando la luce subisce una riflessione interna totale (TIR) e ne risulta incrementata nell'intensità per passaggio attraverso una struttura a guida d'onda, chiamata specchio di risonanza (Fig. 4): ciò è dovuto alla formazione di una cavità di risonanza (o guida d'onda) ed ad una quasi completa riflessione della luce. Nella TIR, per angoli superiori all'angolo critico, le onde luminose sono completamente riflesse. Il campo elettrico, ad ogni modo, non si estingue in maniera discontinua e penetra approssimativamente per una lunghezza d'onda nel mezzo a basso indice di rifrazione, decadendo esponenzialmente. Questo campo è denominato campo evanescente e la sua intensità aumenta con l'angolo di risonanza del biosensore. Questo angolo di risonanza è altamente sensibile all'indice di rifrazione della superficie. L'utilizzo del campo evanescente per esaminare l'indice di rifrazione conferisce una selettività di superficie al sensore, e non saranno rilevati cambiamenti che avvengano al di fuori della superficie stessa. In tal modo, mediante immobilizzazione del ligando sulla superficie del sensore, è possibile effettuare esclusivamente misure su quelle molecole (ligato) che si legano o che si dissociano dal ligando. Lo specchio di risonanza è una struttura semplice, costituita da due strati dielettrici su vetro, che permettono prestazioni elevate e riproducibili. Il dispositivo consiste in una guida d'onda ed in un prisma, entrambi ad alto indice, separati da uno strato di collegamento interposto a basso indice. Un raggio laser (λ =670 nm) sonda per un angolo di 10° intorno al dispositivo. Raggiunto l'angolo di risonanza, la luce di alta intensità passa dal prisma, attraversa lo strato di collegamento, per propagarsi poi nella guida d'onda come onda evanescente superficiale. Il processo di attraversamento è reversibile, il che permette la fuoriuscita di parte della luce. La luce quindi torna indietro attraverso lo strato di collegamento, per poi raggiungere il detector. Per una corretta risoluzione dell'angolo di risonanza, i componenti della struttura ottica sono disposti in modo da ottenere una rotazione della polarizzazione di 90°. Viene utilizzato un sistema di rivelazione in fase, al fine di isolare esclusivamente la componete della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza. Un polarizzatore, collocato davanti al detector, permette un'accurata distinzione dell'angolo in esame; tale dispositivo è estremamente sensibile al campo evanescente della luce che si propaga attraverso lo strato di risonanza, che è indice delle reazioni di formazione o scissione di legami sulla superficie del sensore. L'intensità del campo evanescente decade esponenzialmente, e dopo 100 nm è ridotta ad un terzo della sua intensità. Tale andamento assicura che vengano analizzate esclusivamente le interazioni delle specie immobilizzate. Qualsiasi materiale che dal campione entri all'interno del campo evanescente, provocherà un'alterazione del profilo dell'indice di rifrazione nelle vicinanze della superficie del dispositivo, cambiando così l'angolo di risonanza. Il cambiamento nella posizione del picco di intensità può essere seguito accuratamente, intervallando i campionamenti fino a tre al secondo. Dal sensogramma è possibile derivare un insieme di conclusioni: definire se esiste una interazione specifica fra le specie in studio, trovare analiti che si legano in modo più "forte" rispetto ad altri, capire se le condizioni di rigenerazione permettono di ritornare al segnale iniziale, studiare se, dopo la rigenerazione, la superficie del biosensore è riutilizzabile

VANTAGGI DELLA METODICA Monitoraggio in tempo reale del legame fra le specie in questione (rispetto ad ELISA, RIA, cromatografia di affinità e spettroscopia) Marcatura non necessaria delle molecole che interagiscono fra loro Protocolli con meno fasi, che quindi hanno meno punti critici Processo complessivo medio-alto Alto costo iniziale per la strumentazione, ma abbattimento dei costi per i seguenti accertamenti analitici Lunga durata delle superfici "sensibilizzate" che possono essere riutilizzate per più analisi, qualora la procedura non causi al distruzione di legante e/o ligando Semplice e veloce utilizzo dell'apparecchiatura Sistema stabile e riproducibile Alta precisione, sensibilità e selettività Rapidità di risposta

Affinità, efficacia, e potenza L'affinità di un potenziale hit o lead compound per un target è una misura di quanto fortemente il prodotto si lega ad esse L'affinità può essere misurata utilizzando un processo noto come esperimento di legame o binding

Affinità, efficacia, e potenza L'efficacia è una misura del massimo effetto biologico che un composto può produrre come risultato di legame al target È importante apprezzare la distinzione tra affinità ed efficacia . Un composto con alta affinità non deve necessariamente avere una elevata efficacia . Ad esempio , un antagonista può legarsi con alta affinità ma non ha alcuna efficacia. L'efficacia è determinata misurando il massimo effetto biologico

Affinità, efficacia, e potenza La potenza di un prodotto si riferisce alla quantità di esse necessaria per ottenere un effetto biologico definito: Minore è la dose richiesta, più potente è il composto Tuttavia è possibile per un composto essere molto potente (cioè attivo in piccole dosi), ma avere un bassa efficacia. Potenza può essere determinata misurando la concentrazione di farmaco necessaria per produrre 50% del massimo effetto possibile (EC50). Minore è il valore di EC50, il più potente farmaco. In pratica, pD2 è presa come misura della potenza dove pD2 = log EC50

PRINCIPALI TEORIE RECETTORIALE Identificazione di un saggio biologico Misura della affinità, efficacia, e potenza in recettori e enzimi PRINCIPALI TEORIE RECETTORIALE Teoria dell’occupazione Teoria dell’adattamento indotto Teoria del recettore a due stati Parametri che caratterizzano l'interazione di un farmaco con i suoi siti di legame specifici sono la costante di dissociazione la densità dei siti le costanti cinetiche

RL  R + L Kd = [L].[R]/[LR] (1) L’attività biologica per molti farmaci (L) è dovuta alla formazione di un complesso con il loro recettore La formazione del complesso legando-recettore é una reazione reversibile R + L RL [RL*] E Applicando la legge degli equilibri alla dissociazione del complesso legando/recettore, RL  R + L Kd = [L].[R]/[LR] (1) Densità di siti (Bmax o Rt) viene definita come il numero massimo di molecole di ligando che si possono legare (coincidente con il numero di siti di legame presenti nel recettore) per cellule [Rt] = [R]+[LR] (2) Le costanti cinetiche sono le costanti di velocità della reazione diretta (formazione del complesso), kon, ed inversa (scissione del complesso), koff, per cui è valita la relazione koff/k on = Kd

[LR] = [L].[Rt] / Kd + [L] (3) o B = [L] Bmax / Kd + [L] La relazione fra concentrazione di legando e complesso legando/recettore è simile all’equazione di Michaelis-Menten Dalla (2) risulta che e sostituendo questo valore nella (1) si ottiene: Kd = [L]. {[Rt]-[LR]}/[LR] = [L]. [Rt] - [L] . [LR] /[LR] = [L].[Rt] /[LR] – [L] Risolvendo rispetto [LR]: [LR] = [L].[Rt] / Kd + [L] (3) o B = [L] Bmax / Kd + [L] L’isoterma di legame o isoterma di Langmuir e la sua trasformazioni lineari secondo Scatchard permettono di ricavare i parametri dell’interazione legando-recettore [R] = [Rt ] - [LR] [LR] / [L] = - 1/ Kd. [LR] + [Rt]/ Kd oppure B/ [L]= - 1. B/Kd + Bmax/Kd

[LR] = [F].[Rt]/ Kd + [F] (3) , [LR] = E/k3 (4) , [Rt ] = Em / k3 (5) R + L RL [RL*] k3 E L’intensità dell’effetto è data dalla seguente relazione: E = K3.[LR] [LR] = E/K3 (4) L’effetto massimo, Em , è raggiunto quando tutti i recettori sono occupati: [R] = 0 e [Rt ] = [LR] Em = k3. [Rt ] [Rt ] = Em / k3 (5) Considerando [LR] = [F].[Rt]/ Kd + [F] (3) , [LR] = E/k3 (4) , [Rt ] = Em / k3 (5) E/ k3= [L].[Em]/k3 /Kd + [L] E = [L]. [Em]/Kd + [L] E/Em = [L]/ Kd + [L] (6) Il rapporto E / Em fornisce la frazione di risposta massima ottenuta con la concentrazione [L] di composto

L’affinità, Ka, viene definita come l’inverso della costante di dissociazione Kd Ka = 1 / Kd Il valore di Kd è facile da valutare: quando il farmaco alla concentrazione [F] =[L] raggiunge metà dell’effetto massimo, cioè E / Em = 0.5, allora la Kd deve risultare uguale ad [L] perchè sia verificata l’equazione 6 E/ Em = 0.5 = [L] /Kd+[L] = [L] / [L]+[L] = 1/2 La dose di farmaco che produce il 50% dell’effetto massimo viene indicata con la sigla DE50.

Le curve dose- effetto prodotta da un farmaco Le curve dose ed effetto, espresso come percentuale dell’effetto massimo (E/E m x 100) hanno un andamento iperbolico (Fig. A) che male si presta per correlazioni quantitative struttura/attività Invece, riportando l’effetto in funzione del log [F] o di log [dose] i ottiene una tipica curva signoide (Fig.B) La potenza o affinità è espressa dalla posizione della curva sull’asse delle dosi L’ efficacia, viene valutata dall’effetto massimo La pendenza, così come la fisionomia dell’intera curva, rispecchia il meccanismo d’azione di un farmaco. La ripidità della curva determina l’intervallo di dosaggi clinicamente utili

Teoria dell’occupazione VALIDA NON SPIEGA reazione farmaco-recettore è reversibile la curva dose-risposta e la curva di interazione farmaco-recettore non coincidono è stato raggiunto l’equilibrio esistono farmaci che, pur occupando un determinato recettore, producono una risposta inferiore ad altri che occupano lo stesso recettore, oppure non producono nessuna risposta i recettori sono tutti omogenei l’interazione è stechiometrica i recettori sono indipendenti

Effetto = Attività intrinseca x N° recettori occupati Ariens Affinità : capacità del farmaco di occupare i siti recettoriali Attività intrinseca = Efficacia (Stephenson): capacità di produrre una risposta in seguito all’occupazione dei siti recettoriali Effetto = Attività intrinseca x N° recettori occupati (a) considerando le equazione 5 e 6 che determinano i n° di recettori occupati [Rt ] = [LR] [Rt ] = Em / k3 (5) E/Em = [L]/ Kd + [L] E = Em [L]/Kd +[L] (6) E = a Em [L]/Kd + [L] a Attività intrinseca = 1 Agonista < 1 Agonista parziale = 0 Antagonista Si hanno due stadi: 1- Interazione farmaco-sito recettoriale 2- Produzione effetto biologico

a Attività intrinseca = 1 Agonista < 1 Agonista parziale

a Attività intrinseca = 0 Antagonista

Teoria della perturbazione molecolare Teoria dell’adattamento indotto (induced fit) L’effetto biologico prodotto da un farmaco deriva da una perturbazione reversibile della struttura terziaria dalla proteina recettoriale prodotta da un mutuo adattamento conformazionale del recettore e dell’agonista Belleau elabora successivamente Teoria della perturbazione molecolare Interazione agonista-recettore Perturbazione conformazionale specifica Effetto biologico Interazione antagonista-recettore Perturbazione conformazionale non-specifica

Teoria del recettore a due stati Agonista sposta l’equilibrio verso la conformazione attivata dal recettore (R*) Agonista inverso sposta l’equilibrio in senso opposto Antagonisti neutri non stabilizzano preferenzialmente nessuna delle due forma

Interazione allosterica Quando il sito di legame di un composto ad un recettore è lontano dal sito riconosciuto dal legando endogeno, sito ortoesterico, viene definito come sito allosterico e i farmaci che riconoscono questo sito sono modulatori allosterici Quando un farmaco si lega ad un sito allosterico, la conformazione proteica è alterata, modificandosi l'affinità tra legando e il sito orthosteric La natura allosterica di una interazione si rivela quando concentrazione progressivamente più elevati di modulatore non riescono a provocare spostamenti significativi della curva di saturazione del radio legando , a differenza di quello che succederebbe con un antagonista Spostamenti dal radio legando indotti da un antagonista competitivo (a) o un modulatore allosterico negativo (b)

Cinetica delle reazioni enzimatiche L a reazione enzimatica è irreversibile e il prodotto non sono legati all’enzime     ([ES] cambia molto più lentamente che [P] e [S] [E]0 non cambia nel tempo

Lineweaver-Burk Plot

Lineweaver-Burk Plot

Inhibitor Type Binding Site on Enzyme Kinetic effect Competitive Inhibitor Specifically at the catalytic site, where it competes with substrate for binding in a dynamic equilibrium- like process. Inhibition is reversible by substrate. Vmax is unchanged; Km, as defined by [S] required for ½ maximal activity, is increased. Noncompetitive Inhibitor Binds E or ES complex other than at the catalytic site. Substrate binding unaltered, but ESI complex cannot form products. Inhibition cannot be reversed by substrate. Km appears unaltered; Vmax is decreased proportionately to inhibitor concentration. Uncompetitive Inhibitor Binds only to ES complexes at locations other than the catalytic site. Substrate binding modifies enzyme structure, making inhibitor- binding site available. Inhibition cannot be reversed by substrate. Apparent Vmax decreased; Km, as defined by [S] required for ½ maximal activity, is decreased.

Probably the best known reversible inhibitors are competitive inhibitors, which always bind at the catalytic or active site of the enzyme. Most drugs that alter enzyme activity are of this type. Competitive inhibitors are especially attractive as clinical modulators of enzyme activity because they offer two routes for the reversal of enzyme inhibition, while other reversible inhibitors offer only one. First, as with all kinds of reversible inhibitors, a decreasing concentration of the inhibitor reverses the equilibrium regenerating active free enzyme. Second, since substrate and competitive inhibitors both bind at the same site they compete with one another for binding Raising the concentration of substrate (S), while holding the concentration of inhibitor constant, provides the second route for reversal of competitive inhibition. The greater the proportion of substrate, the greater the proportion of enzyme present in competent ES complexes. As noted earlier, high concentrations of substrate can displace virtually all competitive inhibitor bound to active sites. Thus, it is apparent that Vmax should be unchanged by competitive inhibitors. This characteristic of competitive inhibitors is reflected in the identical vertical-axis intercepts of Lineweaver-Burk plots, with and without inhibitor. Since attaining Vmax requires appreciably higher substrate concentrations in the presence of competitive inhibitor, Km (the substrate concentration at half maximal velocity) is also higher, as demonstrated by the differing negative intercepts on the horizontal axis in panel B. Analogously, panel C illustrates that noncompetitive inhibitors appear to have no effect on the intercept at the x-axis implying that noncompetitive inhibitors have no effect on the Km of the enzymes they inhibit. Since noncompetitive inhibitors do not interfere in the equilibration of enzyme, substrate and ES complexes, the Km's of Michaelis-Menten type enzymes are not expected to be affected by noncompetitive inhibitors, as demonstrated by x-axis intercepts in panel C. However, because complexes that contain inhibitor (ESI) are incapable of progressing to reaction products, the effect of a noncompetitive inhibitor is to reduce the concentration of ES complexes that can advance to product. Since Vmax = k2[Etotal], and the concentration of competent Etotal is diminished by the amount of ESI formed, noncompetitive inhibitors are expected to decrease Vmax, as illustrated by the y-axis intercepts in panel C. A corresponding analysis of uncompetitive inhibition leads to the expectation that these inhibitors should change the apparent values of Km as well as Vmax. Changing both constants leads to double reciprocal plots, in which intercepts on the x and y axes are proportionately changed; this leads to the production of parallel lines in inhibited and uninhibited reactions.

Identificazione di un saggio biologico Farmaci antibatterici sono testati in vitro misurando quanto efficacemente essi inibiscono o uccidono le cellule batteriche in coltura.* Farmaci antivirali Farmaci antitumorali I test in vitro sono utilizzati anche per verificare le proprietà farmacocinetico di composti: Ad esempio, il modello di assorbimento con cellule mono strato Caco -2 viene utilizzato per valutare come un prodotto possa essere assorbito dal tratto gastrointestinale. Microsomi ed epatociti estratti dalle cellule del fegato contengono enzimi del citocromo P450 , e possono essere utilizzati per valutare il probabile metabolismo dei farmaci candidati , nonché di individuare le possibili interazioni farmacologiche. In passato , potrebbe essere un problema importante per isolare e purificare enzimi sufficienti per provare , ma al giorno d'oggi l'ingegneria genetica può essere utilizzato per incorporare il gene per un particolare enzima nelle cellule in rapida crescita come il lievito o batteri , questi poi produrre l'enzima in grandi quantità , rendendo più facile l'isolamento . Per esempio , l'HIV proteasi è stato clonato ed espresso nel batterio Escherichia coli . Una varietà di esperimenti può essere effettuata su questo enzima per determinare se un inibitore enzimatico è competitiva o non competitiva , e per determinare valori IC50 Può sembrare strano per descrivere questo come un test in vitro , le cellule batteriche sono microrganismi viventi. Tuttavia, in test in vivo sono definiti come quelli che vengono effettuati su animali o esseri umani per verificare se gli agenti antibatterici combattonol’infezione.

Esperimenti ex vivo Un test ex vivo significa che il farmaco è stato somministrato per vie diverse ad un animale e che la valutazione dei suoi effetti viene eseguita in vitro con campioni di tessuto o di aliquote di fluidi dell'organismo in fase di studio Un esempio di uno studio ex vivo è l'inibizione dell'aggregazione piastrinica. Gli inibitori dell’aggregazione piastrinica sonno somministrati per via sistemica all'animale, il sangue viene prelevato dopo un predeterminato periodo di tempo, le piastrine sono isolati e l’aggregazione è indotta in vitro dopo aggiunta di ADP. Negli studi ex vivo, la concentrazione del farmaco nella provetta è sconosciuta (ma può eventualmente essere determinato) e gli effetti dei farmaci saranno, essenzialmente, espressi come funzione della dose somministrata o del tempo, a seconda dello scopo dello studio.

Esperimenti ex vivo Esperimenti ex vivo forniscono un importante numero di informazioni per quanto riguarda il destino del farmaco dopo la sua somministrazione. Se il farmaco è stato somministrato per via orale, l’attività osservata implica che: Il farmaco è stato assorbito: L’insufficienza o mancanza di assorbimento (il fatto che il farmaco passa dal tratto gastrointestinale nel sangue) è spesso un problema nella progettazione di nuovi farmaci. Il farmaco non è stato sottoposto ad un intenso metabolismo: Seguendo il suo metabolismo ill farmaco può perdere le sue proprietà farmacologiche o non puo’ più essere in grado di penetrare nel tessuto. Ma anche se il farmaco viene ampiamente metabolizzato, il cambiamento funzionale previsto a volte può avvenire a causa della formazione di un metabolita attivo. Il farmaco ha raggiunto, ha penetrato nel tessuto o nella cellula bersaglio, e ha riconosciuto il bersaglio biologico (ad esempio recettore o enzima) di interesse: Raggiungere una buona penetrazione nei tessuti può anche essere un problema, in particolare quando l’organo bersaglio è il cervello, dal momento che questo organo è molto ben protetto dall'ingresso di farmaci per la barriera emato-encefalica.

Test in vivo I test in vivo vengono eseguiti sugli animali: Comportano l’induzione d’una condizione clinica in animali per la produzione di sintomi osservabili, i quali possono essere eliminati dopo il trattamento con i composti testati. Lo sviluppo di farmaci antinfiammatori non steroidei è stato effettuato inducendo infiammazione su cavie e poi testando composti capaci di sollevare l' infiammazione Gli animali transgenici (con codice genetico modificato) sono spesso usati in test in vivo. Ad esempio, è possibile sostituire alcuni geni del topo con geni umani. Il topo produce il recettore umano o un enzima e questo permette la sperimentazione in vivo contro quel bersaglio. Alternativamente, i geni dei topi potrebbero essere alterati di forma tale che l'animale diventa suscettibile di una particolare malattia (ad esempio cancro al seno). I farmaci possono poi essere testati per vedere come essi impediscono tale malattia.

Test in vivo Certi test in vivo potrebbero rivelarsi non validi. È possibile che i sintomi osservati potrebbero essere causati da un meccanismo fisiologico diverso da quello previsto. Ad esempio, molti farmaci antiulcera promettenti che si sono dimostrati efficaci nella sperimentazione animale erano inefficaci in studi clinici. Diversi risultati possono essere ottenuti in diverse specie animali. Ad esempio, gli esteri metilici della penicillina (profarmaci) vengono idrolizzati in topi o ratti a produrre penicilline attivi, ma non vengono idrolizzati in conigli, cani o esseri umani. Un altro esempio riguarda la talidomide, che è dimostrato teratogeno nel coniglio e gli esseri umani, ma non ha tale effetto nei topi. Nonostante questi problemi, la sperimentazione in vivo è ancora fondamentale per identificare i problemi specifici che possono essere associati all'uso di un farmaco in vivo e che non possono essere raccolti da test in vitro .