[a]Tl= 100 a lc Tecniche usate per lo studio di composti otticamente attivi: un riepilogo Metodi che non richiedono la separazione Polarimetria NMR Diluizione isotopica Calorimetria Tecniche enzimatiche Ad eccezione dell’ NMR sono basate sulla determinazione di un effetto netto e richiedono confronto con dati su un enantiomero puro Polarimetria La rotazione del piano dipende da fattori quali: La concentrazione del soluto La lunghezza del cammino ottico Il solvente La temperatura La lunghezza d’onda Si basa sulla proprietà unica di un composto chirale di ruotare il piano d polarizzazione di una luce polarizzata nel piano Si definisce la rotazione specifica come: [a]Tl= 100 a lc Dove: a=rotazione ottica misurata T=temperatura (°C) l=lunghezza del cammino ottico della cella (dm) c=concentrazione del composto (g/ml) Misure polarimetriche forniscono valori di purezza ottica P= 100 [a]/ [a]max Con [a]max valore di riferimento dell’enantiomero puro

NMR Due approcci per la differenziazione di enantiomeri: Conversione in diastereoisomeri con un reagente chirale es reattivo di Mosher 2. Uso di un solvente chirale es. alcol di Pirkle Metossitrifluoro- metilfenilacetico Uso di solventi chirali: il solvente induce una differenza di chemical shift tra gli enantiomeri . Il rapporto enantiomerico può essere ottenuto direttamente per integrazione. Alcol di tipo Pirkle Determinazione della composizione enantiomerica di una miscela di alanina metil estere in 2,2,2-trifuoro-1-feniletanolo Uso di reagenti di shift otticamente attivi basati su lantanidi: i complessi paramagnetici formati da b-dichetoni con ioni metallici quali Eu3+, Pr3+ interagiscono con composti contenenti gruppi elettrondonatori come ammine, alcoli, chetoni, esteri dando luogo ad uno shift a campi bassi dei nuclei che sono vicini al sito di interazione. Se il complesso è formato da un composto otticamente attivo si creeranno relazioni diastereoisomeriche con i due enantiomeri del composto da analizzare tris(3-trifluoro-metilidrossimetilen)(+) camforato-europio(III)]

Tecniche enzimatiche Ossidazione Decarbossilazione Vantaggi: è possibile determinare un enantiomero presente allo 0.1% in presenza del 99.9 % del suo antipode ottico. Le reazioni enzimatiche sono altamente stereoselettive . Svantaggi: non tutti i composti sono substrati di enzimi. Non tutti gli enzimi sono facilmente disponibili. Tra le reazioni enzimatiche più utilizzate: Ossidazione Sono disponibili commercialmente sia D che L-amminoacido ossidasi Decarbossilazione Sono disponibili solo decarbossilasi per L-amminoacidi. Quindi si può determinare la purezza ottica solo di D-amminoacidi

Tecniche cromatografiche enantioselettive Possono essere applicate: Per la determinazione dell’eccesso enantionerico e.e. = (R-S)/R+S) 100 2. Per la separazione degli enantiomeri Come si opera : Metodo I: Risoluzione indiretta Basata sulla conversione degli enantiomeri in derivati diastereoisomerici mediante reazione con un agente chirale enantiomericamente puro Metodo II: Risoluzione diretta Basata sull’impiego di fasi stazionarie chirali o nel caso della LC fasi mobili chirali

Metodo I: Separazione di enantiomeri mediante formazione di diastereoisomeri Punti critici : Purezza ottica del reagente di derivatizzazione Solo se la p.o. è del 100% i risultati analitici riflettono la composizione enantiomerica. Coppie di enantiomeri coelusicono in HPLC La presenza dell’ enantiomero del reagente chirale altera la determinazione dell’eccesso enantiomerico di A basato sull’integrazione dei picchi dei diastereoisomeri La reazione di derivatizzazione deve essere quantitativa Inoltre non deve dar luogo ad epimerizzazioni ed isomerizzazioni I centri chirali dei derivati devono essere vicini. La distanza deve essere inferiore a tre legami perché i derivati siano differenziati.

GC/LC Reazioni di derivatizzazione per la formazione di diasteroisomeri Vengono tipicamente usati derivati di amminoacidi come agenti chirali per la derivatizzazione di amminoacidi con formazione di peptidi diasteroisomerici. GC/LC Può essere preparato con elevata purezza ottica dalla L-prolina grazie alla resistenza di questo amminoacido ciclico alla racemizzazione. N-trifluoroacetil-L-prolil cloruro Alcoli secondari Formazione di esteri da acidi carbossilici Acido O-metilmandelico (cloruro) Acido 1-metossi-1-metil-1(1-naftil)acetico (cloruro) Formazione di ammidi da ammine

1-feniletilisocianato 1-(1-naftil)etilisocianato Formazione di carbammati da alcoli, di uree da ammine Per la analisi di ammine ed alcoli in LC in fase diretta L-fenilalanina metil estere ed altri metil esteri di amminoacidi Formazione di ammidi da acidi carbossilici

Modello di riconoscimento chirale di Dalgliesh (1952) Metodo II: Analisi diretta di miscele di enantiomeri Modello di riconoscimento chirale di Dalgliesh (1952) Perché si abbia una discriminazione chirale si devono stabilire tre interazioni simultanee tra un enantiomero e la fase stazionaria Le interazioni attive tra selettore e selettando sono diverse nei due enantiomeri Si produce una differenza ben definita nelle energie di formazione dei due complessi diastereoisomerici E’ possibile dimostrare che un solo tipo di interazione è sufficiente a promuovere la differenziazione enantiomerica L’enantiomero che forma il complesso più stabile risulta più trattenuto ed eluito per ultimo dalla colonna. Le interazioni possono essere di tipo: sterico, legame ad idrogeno elettrostatiche dipolo-dipolo trasferimento di carica

I. Coordinazione a metalli di transizione Strategie per la differenziazione delle interazioni selettore-selettando I. Coordinazione a metalli di transizione I metalli di transizione formano complessi di coordinazione con geometrie molto ben definite in cui i ligandi occupano posizioni precise nello spazio. Anche il solvente può partecipare alla coordinazione e forma anche sfere più esterne altamente ordinate. A L M Il principo base della tecnica è dunque: La stabilità del complesso dipende criticamente dalla stereochimica B E’ requisito fondamentale che i complessi siano cineticamente labili cioè la loro formazione e dissociazione sia rapida sulla scala dei tempi della cromatografia Gli equilibri responsabili dell’enantioselettività del sistema costituito dal ligando chirale immobilizzato (Ls), i due soluti enantiomerici (A e B) ed il catione del metallo di transizione (M) in grado d complessare uno o due ligandi nella sua sfera di coordinazione sono descritti dalle equazioni: I complessi misti diasteroisomerici AMLs e BMLs hanno stabilità sufficientemente differenti (KA> o< KB) da rendere possibile la separazione cromatografica

II. Interazioni di trasferimento di carica Strategie per la differenziazione delle interazioni selettore-selettando II. Interazioni di trasferimento di carica Sono interazioni p-p che avvengono tra sistemi aromatici che agiscono da donatori o accettori Accettori p : sistemi con sostituenti elettronattrattori sul sistema aromatico es. NO2 Donatori p : sistemi con sostituenti elettrondonatori sul sistema aromatico es. NH2, OCH3 Sebbene tali interazioni siano di per sé sufficienti per ottenere la discriminazione degli enantiomeri la enantioselettività del selettore è molto aumentata dalla presenza di altre interazioni di legame.

Due tipi di molecole “host” Strategie per la differenziazione delle interazioni selettore-selettando III. Processi di inclusione Alcune molecole per le caratteristiche strutturali hanno la proprietà di includere al loro interno delle molecole ospiti Interazioni di inclusione host-guest La cromatografia chirale sfrutta interazioni host-guest altamente stereoselettive. Due tipi di molecole “host” Interno idrofilico Esterno idrofobico Interno idrofobico Esterno idrofilico =gruppi idrofilici =gruppi idrofobici Include ospiti idrofilici Include ospiti idrofobici Es. polieteri macrociclici eteri corona Es. ciclodestrine

GC LC Fasi chirali contenenti derivati di amminoacidi Sono il primo esempio di fasi stazionarie chirali per la risoluzione di amminoacidi e peptidi GC Le fasi basate su dipeptidi presentano una maggiore termostabilità Selettori legati a polimeri silossanici di opportuna viscosità sono stabili fino a 250°C Il selettore è valina –t-butilammide Tali fasi sono usate per : a-amminoacidi amminoalcoli ammine a- e b-idrossiacidi 1,2 e 1,3-dioli Come N,O-perfluoroacilderivati LC N-acilvalina legata covalentemente alla fase stazionaria avente gruppi amminici (silice 3-amminopropilica) In fasi mobili non acquose Es: esano/2-propanolo Modello di interazione mediante formazione di legame idrogeno su due punti Gli enantiomeri della serie D eluiscono prima delle forme L

GC LC Fasi chirali contenenti metalli di transizione Complessi di metalli di transizione dissolti in una fase liquida inerte (squalano o polisilossani) che ricopre la superficie della silice fusa GC Permettono la separazione di specie che non sono in grado di fungere da donatori di legame ad idrogeno o che non possono essere derivatizzate : Alcheni Ossirani Tetraidrofurani Lattoni Spirochetali etc. LC Il selettore è un amminoacido immobilizzato sulla superficie del supporto Il catione metallico è presente nella fase mobile acquosa Introdotto da Davankov è limitata a specie in grado di complessare cationi divalenti in soluzione acquosa. Il complesso L-L è destabilizzato da interazioni steriche tra una molecola di acqua coordinata nella posizione assiale dello ione rame e il soluto. Il complesso D-L è stabilizzato dall’interazione idrofobica tra la catena polistirenica e la porzione apolare del soluto. L’ordine di eluizione sarà L prima di D Con ligandi tridentati la partecipazione del gruppo vicinale (es. gruppo carbossilico) può produrre una stabilizzazione più efficiente della molecola di acqua ed essendo possibile solo per L si avrà inversione dell’ordine di eluizione

LC Fasi chirali di tipo Pirkle Furono sviluppate da Pirkle sulla base delle acquisizioni sulla risoluzione enantiomerica con solventi chirali. Si basano su interazioni di tipo p-p e formazione di legami ad idrogeno in solventi non polari usati come fase mobile. Il (R)-2,2,2-trifluoro-1-(9-antril)etanolo forma due complessi diastereoisomerici di diversa stabilità con composti racemici 3,5-dinitrobenzoilati. Sono state progettate altre fasi stazionarie Trifluoro antranilcarbinoli Amminoacidi 3,5-dinitrobenzoilati N-Naftilamminoacidi Modello per l’enantioselezione: Si ha formazione di legami idrogeno fra i frammenti ammidici. Le porzioni aromatiche delle molecole assumono una disposizione relativa parallela (p-stacking)

Fasi chirali contenenti ciclodestrine Le ciclodestrine sono dei oligosaccaridi ciclici derivanti dall’azione del microorganismo Bacillus macerans sull’amido. Contengono 6 o più unità a-(D)-glucopiranosidiche legate mediante legami a 1,4-glicosidici. 6 unità a-ciclodestrina 7 unità b-ciclodestrina 8 unità g-ciclodestrina Diametro cavità a-CD: 4.7-5.2 Å b-CD: 6.0-6.5 Å g-CD: 7.5-8.5 Å La conformazione del macrociclo presenta una struttura toroidale sia allo stato solido che in soluzione. L’apertura più ampia è occupata solo da gruppi ossidrilici secondari L’apertura opposta più piccola è occupata da gruppi ossidrilici primari. La cavità interna è idrofobica per l’assenza di gruppi ossidrilici Le estremità sono idrofile per la presenza di gruppi ossidrilici. L’enantioselettività è associata alla struttura chirale all’ingresso della cavità in cui sono esposti i gruppi OH in posizione 2 e 3.

LC GC Fasi chirali contenenti ciclodestrine Si usano ciclodestrine (principalmente la b) immobilizzata sulla fase stazionaria. Si opera in fasi inversa con fasi mobili acqua/metanolo o acetonitrile. Meccanismo dell’enantioselezione con fasi mobili acquose: Inclusione di una porzione aromatica o lipofila del soluto nella cavità della ciclodestrina. Interazioni addizionali tra porzioni polari del soluto e ossidrili secondari presenti sulla apertura principale del macrociclo GC Sono usate CD peralchilate, regioselettivamente alchilate-sililate, acilate, perfluoroacilate legate a supporti come fasi stazionarie. Tali fasi sono usate per : eteri esteri, lattoni composti polialogenati cicloalcani composti organometallici.

Fasi chirali contenenti derivati di polisaccaridi Polisaccaridi naturali (amido, cellulosa) sono utili per la ricognizione enantioselettiva. Tuttavia le prestazioni cromatografiche sono modeste Sono stati preparati una serie di derivati. CTA cellulosa microcristallina triacetato è la prima fase stazionaria chirale di questo tipo ad essere stata sviluppata. L’enantioselettività è strettamente legata alla struttura microcristallina del polisaccaride. Selettori chirali polimerici adsorbiti su silice macroporosa. Ogni derivato ha una particolare enantioselettività verso specifiche classi di composti. Sono molto versatili. Fasi mobili di tipo esano/alcol Opportuni modificanti (acido acetico, dietilammina) permettono di effettuare la risoluzione di composti a carattere acido e basico. Alcune fasi polisaccaridiche sono adatte al’eluizione con eluenti acquosi.

Fasi chirali contenenti proteine La capacità di alcune coppie proteina –ligando di formare complessi molto forti è alla base della cromatografia di affinità La proteina è di solito immobilizzata su gel di silice macroporoso funzionalizzato con gruppi attivi (epossidici, aldeidici) che possano formare legami covalenti con residui degli amminoacidi della proteina (es. lisina) Esempio di immobilizzazione di una glicoproteina acida a1-AGP E’ utilizzata per la risoluzione di enantiomeri di composti di interesse farmaceutico:Ammine, Sali di ammonio,Acidi carbossilici, Composti polari neutri. Le proteine più utilizzate sono: Albumine seriche bovine ed umane BSA, HSA Glicoproteina acida a1-AGP Ovomucoide OVM Cellobioidrolasi CBH Pepsina Le proteine OVM AGP e CBH contengono carboidrati potenzialmente coinvolti nella ricognizione degli enantiomeri Fasi mobili acquose: la composizione e la natura del modificante organico influenza molto la ritenzione e la enantioselettività. Meccanismo di ritenzione ed enantioselezione per composti ionizzabili: interazioni idrofobiche ed interazioni elettrostatiche

(+)-10-canforsolfonato Tecniche LC basate sull’uso di additivi chirali Si basano sui tipi di interazione visti nel caso delle fasi chirali 1. Complessazione metallica N-alchil-L-idrossiproline (C-7, C-10, C-16) Usate per applicazioni con C-18. La fase mobile Cu(II) acetato in metanolo/acqua Il ligando è immobilizzato da interazione idrofobica tra le catene alchiliche e i residui C-18 della fase stazionaria. L’ordine di eluizione per amminoacidi è L prima di D. Infatti nel complesso a ligandi misti solo per D il residuo amminoacidico R può interagire con le catene C-18 2. Formazione di coppie ioniche Se l’agente di coppia ionica è chirale si formeranno coppie diasteroisomeriche che possono essere separate su una colonna per fase inversa (+)-10-canforsolfonato In molti casi è necessaria più di una interazione per assicurare la enantioselezione. Con 1,3-amminoalcoli si realizza anche una interazione di legame ad idrogeno tra OH e C=O della canfora. Interazione di legame ad idrogeno Interazione di coppia ionica