TECNICHE RADIOISOTOPICHE

Struttura dell’atomo Nucleo centrale con internamente protoni +, e neutroni Esternamente elettroni

Numero di Massa (A) A= Z+ N ; Z= numero atomico; N= numero di neutroni L’atomo è neutro Il numero di e-= numero di protoni = Z

ISOTOPI Atomi con diverso Numero di massa A (cioè con diverso numero di neutroni), ma con lo stesso numero atomico Z 11 6 C 12 6 C 13 6 C 14 6 C Tutti hanno 6 protoni e 6 elettroni = Z Ma 5,6,7,8 neutroni N= (A-Z)

Come vengono indicati gli isotopi numero in alto indica il numero di massa 14 C numero in basso indica il numero atomico 6 Si usa scrivere solo il numero di massa

Numero di isotopi Gli elementi naturali sono costituiti da miscele di isotopi Il numero di isotopi x ogni elemento è variabile Nucleo di idrogeno ha un solo protone ed è indicato come 1 1 H 1= numero di massa; 1= numero atomico Ha 2 isotopi che hanno entrambi 1 protone ma diverso numero di neutroni

Altre forme del nucleo di H 2 H contiene 1 neutrone DEUTERIO 3 H contiene 2 neutroni TRIZIO Il Trizio è l’unico isotopo radioattivo

Numero di isotopi In natura sono presenti circa 90 elementi e 270 isotopi ISOTOPI ISOTOPI NATURALI ISOTOPI ARTIFICIALI 60 Co = isotopo artificiale utilizzato in radioterapia ( 27 protoni e 33 neutroni

STABILTA’ DEGLI ISOTOPI Isotopi hanno diversa stabilità Stabilità dipende da: N/Z ( numero di neutroni / numero di protoni) Quasi tutti gli isotopi naturali sono stabili Quasi tutti gli isotopi artificiali instabili Gli isotopi instabili sono chiamati anche RADIOISOTOPI

ISOTOPI STABILI Per gli elementi a basso numero atomico: -Isotopi stabili numero neutroni/numero protoni=1 -Per gli elementi ad alto numero atomico: -Isotopi stabili numero neutroni/numero protoni >1

Isotopi instabili o Radioisotopi Radioisotopi tendono a raggiungere spontaneamente una configurazione stabile COME? Emettendo particelle cariche e/o rediazioni elettromagnetiche Tale emissione si dice DECADIMENTO Il decadimento porta direttamente o attraverso più tappe ad un isotopo stabile

TIPI DI DECADIMENTO Decadimento x emissione di Beta – o negatroni Degadimento x emissione di beta + o positroni Decadimento x emissione di particelle  Decadimento x emissione di raggi 

Decadimento x emissione di particelle beta – o negatroni Si verifica quando il nucleo è instabile x un eccesso di neutroni Neutrone Protone + Negatrone(beta-) Un neutrone in eccesso è trasformato in protone che resta nel nucleo ed in 1 elettrone  (negatrone) che viene emesso

Conseguenza del decadimento beta - 32 P 32 S +beta- N/Z decresce Z aumenta di 1 unità ( Z= 15x P, Z=16xS) A( numero di massa) resta costante

Utilizzo dei beta – emittenti in biochimica 3 H e 14 C x marcare composti organici 35 S x marcare la metionina in studi di sintesi proteica 32 P x marcare acidi nucleici

Decadimento x emissione di particelle beta + o positroni Si verifica quando il nucleo è instabile x un difetto di neutroni Il protone in eccesso decade formando un neutrone e una partcella beta carica + Protone Neutrone + Positrone (beta+)

Conseguenze di decadimento beta + 22 Na 22 Ne + positrone Nucleo perde un protone e guadagna un neutrone Rapporto N/Z aumenta Na (22-11/11)=1, Ne (22-10/10)=1,2 Numero Atomico diminuisce di una unità Numero di massa è costante

Caratteristiche della particella beta+ La particella beta+ è molto instabile Dopo aver percorso 1 mm si annichila interagendo con 1 elettrone e si trasforma in 2 raggi gamma emessi a 180° l’uno rispetto all’altro, di pari energia

Applicazioni degli isotopi che emettono positroni Tomografia x emissione di positroni o PET scanning: Tecnica x esaminare il cervello ed individuare le sue aree attive ed inattive

Decadimento x emissione di particelle  Gli isotopi ad alto numero atomico decadono emettendo particelle alfa Le particelle alfa corrispondono a nuclei di Elio ( 2 protoni e 2 neutroni)

Conseguenze di emissione  226 Ra 4 He Rn 206 Pb 88 radio 2 86 radon 82 Diminuzione del numero atomico di 2 unità Diminuzione del numero di massa di 4 unità

Decadimento x emissione di raggi gamma Raggi gamma sono radiazioni elettromagnetiche con compresa tra nm Emissione di raggi gamma può avvenire x TRANSIZIONE ISOMERICA o per CATTURA ELETTRONICA Transizione isomerica corrisponde ad un cambiamento dello stato energetico del nucleo CATTURA ELETTRONICA, un processo nel quale un protone cattura un elettrone dell’orbitale K ( più interno) trasformandosi in un neutrone con sviluppo di energia elettromagnetica

TRANSIZIONE ISOMERICA Decadimento è spesso successivo ad un antecedente decadimento di particelle alfa o beta 151 I beta Xe 151 Xe + raggi gamma Non cambia né il numero atomico né di massa In seguito all’emissione di particelle beta – il nucleo si può trovare in una condizione energetica instabile, x cui x tornare ad uno stato stazionario emetterà energia sottoforma di raggi gamma

Decadimento x cattura elettronica Protone + Elettrone Neutrone+ raggi gamma Protone cattura un elettrone dello strato K + interno Protone diviene neutrone Si sviluppa energia elettromegnetica (raggi gamma) Numero di massa invariato Numero atomico diminuisce

Decadimento radioattivo E’ la tendenza di radioisotopo di raggiungere una situazione di stabilità emettendo radiazioni alfa, beta o gamma L’energia associata all’emissione è in eV (elettronvolt) 1eV = 1.6 x j rappresenta l’energia acquisita da un elettrone quando viene accelerato da una ddp pari ad 1 Volt

Valori energetici associati all’emissione di particelle I valori energetici più elevati sono quelli associati all’emissione di particelle alfa (4-8 MeV) Emissione di particelle beta producono valori energetici inferiori a 4 MeV L’energia dei raggi gamma ( radiazioni elettromagnetiche) è inferiore a 10 MeV e direttamente proporzionale alla frequenza E= h/ v E= hc/ h = costante di Plank, v= frequenza; c= velocità luce

Velocità di decadimento e tempo di dimezzamento Velocità di decadimento radioattivo segue una cinetica di 1° ordine V = dN/ dt= KN Velocità di decadimento di N atomi è direttamente proporzionale, in ogni istante, al numero di isotopi radioattivi Nella pratica si preferisce esprimere la velocità di decadimento in termini di TEMPO DI DIMEZZAMENTO o EMIVITA

TEMPO DI DIMEZZAMENTO o EMIVITA tempo necessario affinchè metà degli atomi radioattivi inizialmente presenti nel campione decadano Ogni isotopo ha un caratteristico tempo di dimezzamento 3 H anni 14 C 5760 anni 32 P 14.2 giorni 35 S 87.2 giorni

Unità di misura della radioattività SI: Bequerel (Bq) : 1Bq= 1 disintegrazione x secondo (d.p.s.) Curie (Ci)= quantità di materiale radioattivo con un numero di disintegrazioni nucleari per secondo pari a quello di 1g di radio (3, ) In campo biologico si usa il  Ci, mCi

Il numero di disintegrazioni emesse dipende dalla purezza del campione, x cui si può esprimere il decadimento radioattivo come Attività specifica Attività specifica= Velocità di decadimento / unità di massa dell’isotopo =  Cu/  mole

Apparecchi x misurare la radioattività Non sono in grado di misurare tutte le disintegrazioni nucleari che avvengono nell’unità di tempo in un radionuclide rivelano solo una frazione di disintegrazioni corrispondente alle conte x minuti = cpm

Dpm (disintegrazioni xminuti) Dpm si possono calcolare dalle cpm se si conosce l’efficienza dell’apparecchio Un campione standard di cui conosco la radioattività reale (dpm)= disintegrazioni x minuto Del campione standard mi vado a misurare le cpm Campione in esame misuro cpm e faccio proporzione

Contatori a scintillazione liquida Più usati in campo biologico X misurare radiazione associata a beta emittenti ( 3 H, 14 C, 32 P, 35 S) il campione radioattivo è miscelato ad un liquido di scintillazione ( uno o più composti aromatici + fluoruro primario) Le particelle beta emesse dal campione radioattivo interagiscono con i composti aromatici del liquido di scintillazione e trasferiscono ad esso parte della loro energia

Gli elettroni dei composti aromatici del liquido di scintillazione passano da uno stato fondamentale ad uno eccitato Quando elettrone torna allo stato fondamentale emette un fotone I fotoni emessi dai composti aromatici non sono rilevabile con accuratezza x questo essi interagiscono con il fluoruro primario ed in questo modo possono essere rivelati Fotomoltiplicatore amplia e converte il segnale luminoso in uno elettrico

autoradiografia Capacità di sostanze radioattive di impressionare una lastra fotografica Utile x visualizzare una sostanza radioattiva in un gel elettroforetico, o in cellule o tessuti

Come si effettua l’autoradiografia Serve: Una sorgente radioattiva presente nel campione di analisi Pellicola = emulsione sensibile= costituita da cristalli di alogenuro di Ag in una fase solida granulosa Campione radioattivo dissipa la sua energia radioattiva nell’emulsione, Ag è ridotto ad Ag metallico e si deposita sulla pellicola Soluzione di sviluppo che permette di visualizzare i depositi di Ag sottoforma di annerimenti sulla pellicola Soluzione di Fissaggio: che lava l’eccesso di alogenuro di Ag

Applicazione autoradiografia Visualizzare su un gel frammenti di acidi nucleici marcati con 32P, Individuare biomolecole in cellule o organuli cellulari

Saggio di attività della PARP 1. Si preparano gli estratti proteici a partire dai nuclei 2. Si allestisce una miscela di saggio contenente: 20 μg dell’estratto proteico Una soluzione tampone ( miscela di reazione) con un pH=7 P 32 NAD + 3. Si incuba la miscela a 37°C per 10 minuti 4. Si aggiunge acido tricloroacetico al 30% (TCA) 5. Si centrifuga la miscela per ottenere un precipitato proteico e un surnatante

Per un ulteriore purificazione del precipitato…………… 1. Si preleva il precipitato per risospenderlo in TCA al 7% 2. Si filtra il precipitato con un sistema in cui viene fatto il vuoto 3. Si lava il filtro volte con TCA 4. Si fa sciugare il filtro 5. Si pone il filtro in una fiala contenete il liquido di scintillazione e si agita in modo da far sciogliere il filtro 6. Si fa una conta allo scintillatore

Attività enzima U/ml= cpm campione –cpm bianco / radioattività della miscela t incubazione microlitri di capione nel saggio Utot= U/ml x volume totale di estratto

: 32 P-NAD : 32 P-NAD + 3ABA (1mM)

Polimer blot 1.Si procede con un SDS-page. Nei pozzetti verrano caricati:  Estratto proteico di Dalton- markers  Estratto proteico contenente la PARP non attiva (Ext-1)  Estratto proteico contenente la PARP attiva (Ext-2) 2. Si effettua un trasferimento su filtro di nitrocellulosa 3. Si incuba il filtro con il P 32 poliADPR 4. Si effettuano dei lavaggi con acqua bidistillata 5. Si espone il filtro per autoradiografia

Dalton-markers Ext-1 Ext-2 Ext-1 Non è presente nessun segnale Ext-2 Sono presenti diversi segnali corrispondenti a tutte le proteine etero modificate non covalwentemente

Activity blot Utilizzata per identificare nell’estratto proteico esclusivamente la PARP automodificata 1.Si fa un SDS-page con lo stesso procedimento messo in atto per il polimer blot 2. Si pone il filtro in una soluzione di rinaturazione e poi lo si incuba con il P 32 NAD + e non con P 32 poliADPR 3. Si espone il filtro per autoradiografia Dalton-markers Ext-1 Ext-2

Accettori covalenti SDS_PAGE: DM, campione incubato con 32PNAD Trasferimento su nitrocellulosa Esposizione x autoradiografia oppure Non effettuo il trasferimento Secco il gel ed espongo in autoradiografia