SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione. E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici. Possiamo determinare i parametri cinetici (KM , Kcat o attività specifica) di un particolare enzima. CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli) { CONTINUI SAGGI DI ATTIVITA’ DISCONTINUI o A PUNTI FISSI In un saggio di attività enzimatica noi misuriamo il prodotto della reazione, più di rado misuriamo il consumo di substrato.
E + S E + P (prodotto colorato - cromoforo SAGGI CONTINUI Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui Per lo più usano metodi spettrofotometrici SAGGI DIRETTI E + S E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo) Esempio: + NADH Piruvato Lattato Deidrogenasi (LDH) + NAD+ Lattato
E1 + S E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) SAGGI ACCOPPIATI E1 + S E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) E2 + P E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato) L-treonina aldolasi Esempio: + L-treonina glicina acetaldeide alcol deidrogenasi + NADH + NAD+ acetaldeide alcol etilico ACCOPPIAMENTO CON REAZIONE IRREVERSIBILE E1 E2 A B C
[Etot] = 0,13 mM Vmax = 26 0,3 mM min-1 KM = 0,19 0,01 mM kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1
SAGGI DISCONTINUI Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o fluorofori e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono diverse da quelle del saggio. Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto (o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio HPLC, saggi biologici o immunologici. Presenza di un fondo ( background ) elevato; ad esempio di assorbanza dovuta alle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla lunghezza d’onda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il saggio e poi eliminare la fonte di disturbo.
ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI PRELIEVO DI ALIQUOTE AD INTERVALLI DI TEMPO ENZIMA + SUBSTRATO REAZIONE IN CORSO La reazione viene bloccata con acido, denaturanti delle proteine, calore, inibitori dell’enzima Il prodotto di reazione viene quantificato con vari metodi E1 + S E1 + P P-X metodi colorimetrici Quantificazione con HPLC Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo 1a FASE 2a FASE X E2 Metodi radioisotopici
Esempio: 1a FASE Glutamato 1-semialdeide (GSA) 5-aminolevulinato (ALA) 2a FASE GSA + DMBA COMPOSTO COLORATO [GSA] = 1 mM Pendenza = vi (mM s-1) [GSA] = 0,7 mM [GSA] = 0,5 mM [GSA] = 0,4 mM
Metodi radioisotopici Si basano sull’utilizzo di forme radiomarcate di un substrato Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile separare facilmente i substrati dai prodotti Esempio: misura dell’attività di un’aminotrasferasi + 1a FASE Miscela di reazione lavaggio eluizione Conteggio radiattività 2a FASE (separazione cromatografica e conteggio della radiattività) colonna cromatografica a scambio anionico aminoacidi chetoacidi
METODI IMMUNOCHIMICI L’utilizzo di anticorpi monoclonali o policlonali, prodotti contro un particolare enzima, può fornire la base per un dosaggio enzimatico, basato sul metodo ELISA, altamente specifico, in grado di distinguere isoenzimi o enzimi diversi che catalizzano reazioni identiche. Questi metodi sono di notevole importanza diagnostica Dosaggio immunometrico mediante anticorpi marcati con enzimi Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA)