CALORIMETRIA La CALORIMETRIA è la misura quantitativa del calore richiesto o rilasciato durante un processo chimico. La misura si effettua con un calorimetro. Verrà descritta la tecnica di: - calorimetria di titolazione isoterma

La calorimetria di titolazione isoterma (ITC) è una tecnica termodinamica per studiare reazioni indotte da un reagente aggiunto al sistema. E’ molto usata per reazioni biochimiche. Quando il reagente è aggiunto, viene generato o acquisito del calore e la misura di questo calore permette la determinazione accurata della costante di legame (K B ), della stechiometria della reazione (n), dell’entalpia (  H) e dell’entropia (  S), dando quindi un profilo termodinamico completo del sistema con un singolo esperimento.

In un tipico esperimento ITC di un sistema biochimico, una soluzione di “macromolecola” viene titolata con un “ligando” introdotto con una siringa a temperatura costante. Quando il ligando è iniettato nella cella avviene l’interazione ed il calore svolto o acquistato è proporzionale alla quantità di legame formato. Quando la macromolecola nella cella è saturata dal ligando il segnale termico diminuisce fino al valore del calore di diluizione.

Nell’esperimento in figura, 18 aliquote di ligando sono state aggiunte alla proteina. L’area relativa al segnale di ogni aggiunta (in alto) è proporzionale al calore totale rilasciato per ogni aggiunta. Quando il calore integrato viene riportato in funzione del rapporto molare tra ligando e macromolecola, viene ottenuta l’isoterma di legame (in basso). La curva interpolata (in rosso) permette di ottenere i migliori parametri termodinamici (stechiometria, costante di legame e entalpia del processo).

La determinazione precisa della concentrazione di macromolecola e di substrato è importante. La quantità di calore svolto per aggiunta del ligando è: V o = volume della soluzione in cella  H b = entalpia per mole di ligando [M] t = concentrazione totale di macromolecola K a = costante di legame [L] = concentrazione di ligando libero

L’equazione è ricavata in questo modo:

Importante: Le equazioni sono ricavate in accordo con un modello di interazione. Nel caso precedente: un unico sito di interazione per macromolecola. Se più ligandi si legano alla macromolecola bisogna modificare l’equazione del Q inserendo la stechiometria con un modello di siti uguali ed indipendenti. Se i siti sono n per ogni macromolecola:

Per classi multiple di siti uguali ed indipendenti si ha: Va fatta però attenzione al fatto che nel modello di siti uguali ed indipendenti la costante di equilibrio NON è uguale per tutti i singoli processi di legame, è la costante microscopica che è uguale. Di conseguenza anche l’entalpia di processo è quella microscopica del singolo ligando che lega la macromolecola.

Poiché il calorimetro misura qualsiasi quantità di calore prodotto o acquistato va considerato anche il calore di protonazione o deprotonazione (entalpia di ionizzazione) legato al tampone utilizzato nell’esperimento. In questo caso può essere utile fare due esperimenti con diversi tamponi a diversa entalpia di ionizzazione.

I reagenti vanno dializzati con cura contro il tampone per evitare differenze di concentrazione del tampone nelle soluzioni da mescolare che producono calore di diluizione non eliminabile. Le soluzioni vanno de-gassate per evitare la formazione di bolle che peggiora la linea di base.

Per ottenere n, K a e  H b, l’equazione generale: viene espressa in termini di concentrazione totale di ligando:

Per passare dalla prima alla seconda espressione: Da questa seconda espressione si ottiene una quadratica che risolta dà i valori di [M b ] (uno solo dei due ha senso fisico) che introdotti nella prima espressione danno il valore di [L f ] che può essere introdotto nell’espressione generale.

Espressione quadratica per [M b ]: Solo una delle due soluzioni avrà un valore positivo per [M b ] I parametri sono ottenuti con un metodo di best-fit come il Marquardt

La concentrazione di macromolecola e di ligando è critica per una buona misura: - la concentrazione iniziale di macromolecola e ligando va misurata accuratamente - è comodo valutare il parametro c = K a [M] n Per una determinazione accurata della costante di equilibrio è consigliato lavorare con c = 1 ÷ Valori grandi di c portano a pochi punti sperimentali nella zona di equivalenza Valori piccoli di c portano ad una zona di sigmoidale molto allargata (quasi lineare) dove è difficile valutare il punto di equivalenza.

Un esempio di studio con calorimetria di titolazione isoterma: interazione del Citocromo c di cuore di cavallo con anticorpi monoclonali. L’anticorpo lega in prossimità della lisina 60

E’ stato dimostrato che, sebbene la superficie di contatto tra anticorpo ed antigene sia grande (650 – 1000 Å 2 ), solo pochi residui di amminoacidi contribuiscono all’interazione. Questo può essere confermato con la calorimetria. Esperimento di calorimetria per l’interazione del Cyt c con l’anticorpo MAb 5F8. Il titolante è l’anticorpo. Non poteva essere calcolata la costante di legame (troppo alta) e quindi non ci sono punti nella zona di equivalenza. K a è stata valutata mediante un esperimento di titolazione per fluorescenza

La variazione di energia libera è stata calcolata da:  G 0 = -RT lnK a Conoscendo il  H calorimetrico è stata valutata  S: K a = 1,4 x (M -1 )  G 0 = - 13,9 (kcal/mole)  H = - 21,7 (kcal/mole)  S = -26,3 (cal/mole K)  C p = (cal/mole K) =-719 (joule/mole K) Diminuzione di entropia → minor mobilità dei gruppi coinvolti nell’interazione (catena laterali, acqua). Il valore della variazione della capacità termica è misurato con esperimenti a diversa temperatura

Eseguendo titolazioni in tamponi diversi può essere calcolato il numero di protoni scambiati durante il processo di legame. L’entalpia di ionizzazione nel tampone fosfato è molto minore di quella in TRIS-HCl (1 kcal/mole; 11 kcal/mole). tris(idrossimetil)amminometano cloridrato Se la variazione di entalpia misurata in TRIS è meno esotermica di quella in fosfato allora i protoni sono acquisiti dal sistema durante la complessazione.

Il  H apparente (  H associazione +  H protonazione) è: Non può essere stabilito se i protoni sono presi dall’anticorpo o dal citocromo, ma il loro numero totale è noto dall’equazione: Si ottiene scrivendo la formula di  H b app per i due tamponi e sostituendo in  H b Nel caso in esame il trasferimento di protoni è praticamente zero.