Cosa si intende per CARIOTIPO.. … di un individuo, di una specie, di una linea cellulare in coltura, di un tumore, o di una linea cellulare tumorale? … stabile o stabilizzato, c. variabile, c. aberrante, etc.? … analisi del cariotipo? Il termine CARIOTIPO è usato anche per indicare la serie completa di cromosomi di una cellula (normale o aberrante), di una specie, o di un singolo organismo. Il CARIOTIPO è definito dal numero e dalla morfologia di tutti i cromosomi presenti nel nucleo della cellula di un determinato organismo (eucariote). L’analisi al microscopio ottico permette di studiare un cariotipo di un sistema cellulare determinando il numero cromosomico e, per ciascuno di essi: - la lunghezza, la posizione del centromero, la distribuzione caratteristica delle bande, ottenute da colorazioni specifiche (‘pattern di bandeggio’), i cromosomi sessuali; la presenza di alterazioni morfologiche (mutazioni strutturali) rispetto al cariotipo standard, di cui vanno indicate le caratteristiche.

IL CARIOTIPO UMANO è costituito da un numero diploide 2n=46 cromosomi (22 coppie di autosomi + 1 coppia di cr. sessuali eteromorfi, X e Y) raggruppati in 6 gruppi (A-G), di cui 3 grandi metacentrici, … … … Esempio di un Cariogramma di un individuo di sesso maschile, normale (46, XY). Colorazione Giemsa.

I CROMOSOMI del CARIOTIPO UMANO Gruppo A (1-3) Gruppo B (4,5) Gruppo C (6-12) Gruppo E (16-18) Gruppo D (13-15) Gruppo F (19, 20) Gruppo G: 21, 22 cariogramma idiogramma Nel braccio corto delle 5 coppie di cromosomi acrocentrici, che appartengono ai gruppi D e G (cromosomi 13-15; 21 e 22) risiedono le regioni NOR (Nucleolar Organizing Region).

E … cosa si intende per CARIOGRAMMA? Viene costruito per analizzare il cariotipo di un tessuto, un organismo, o una linea cellulare. Un CARIOGRAMMA è la rappresentazione ‘ordinata’ di tutti gli elementi del corredo cromosomico reale, ottenuto da preparati cromosomici in metafase. A ciascun cromosoma della ‘piastra cromosomica’ dell’individuo studiato viene appaiato il suo omologo e ciascuna coppia di omologhi viene disposta in ordine decrescente, per dimensioni e posizione del centromero. In esso sono visibili le caratteristiche morfologiche del corredo cromosomico di un organismo -ottenuto dalle cellule di un suo tessuto-, o di una linea cellulare.

Infine, cosa si intende per IDIOGRAMMA? Questo ‘schema’ è utilizzato come riferimento per studiare il cariotipo di una specie L’ IDIOGRAMMA una rappresentazione ‘ideale’ e schematica che indica come appare il cariotipo standard di una determinata specie (cioè dei suoi individui) riferito a tutte le sue caratteristiche morfologiche e al pattern di bandeggio (generalmente bande G). * Termine usato in citogenetica: rappresentazione grafica schematica dell’assetto cromosomico aploide (n) di una specie animale o vegetale in cui ogni elemento è identificabile con numerazione da 1 a n. L’idiogramma mostra quindi tutti gli elementi che descrivono le caratteristiche dei cromosomi del cariotipo di una specie, compresa la successione di bande e interbande di ciascun cromosoma, all’interno delle quali sono localizzati geni, sequenze e altre regioni.

Criteri di classificazione dei cromosomi Infine le caratteristiche di un cromosoma vengono stabilite in base a precisi criteri morfologici: Criteri di classificazione dei cromosomi - TCL = Total Chromosome Lenght; - Arm Ratio (AR): rapporto tra la lunghezza di ciascuno dei due bracci cromosomici); - Indice centromerico (Ic), determinato dalla posizione del centromero sul cromatidio ; - Presenza di costrizioni secondarie - Presenza di satelliti Pattern di bandeggio Telomeri Criteri di identificazione di un cromosoma, escluse le bande.

Costrizioni secondarie. Nel cariotipo di molte specie animali e vegetali si può distinguere -nei bracci di alcuni cromosomi- la presenza di regioni di cromatina particolarmente sottili o chiare, chiamate costrizioni secondarie: il loro livello di condensazione è minimo Durante l’interfase queste regioni di cromatina sono intimamente associate al nucleolo, che scompare all’inizio della mitosi (alla fine della profase) e ricompare nel nucleo delle cellule figlie all’inizio della nuova interfase. Queste regioni contengono le sequenze degli organizzatori nucleolari e per questo sono chiamate comunemente NOR (Nucleolar Organizing Region) ‘reclutate’ nella formazione del nucleolo.

A) acrocentrico; B) telocentrico; C) submetacentrico; D) metacentrico. Indice centromerico Il centromero non occupa la stessa posizione in tutti i cromosomi e divide ogni cromatidio in due parti, i bracci, la cui lunghezza dipende dalla posizione del centromero-cinetocoro. Per lo più i bracci sono di lunghezza diversa. La posizione del centromero viene definita dal rapporto fra la lunghezza del braccio corto P (dal francese petit) e la somma tra lunghezza del braccio corto P con quella del braccio lungo Q: Ic = P/(P+Q) A) acrocentrico; B) telocentrico; C) submetacentrico; D) metacentrico. acrocentrici: centromero in posizione terminale; telocentrici: centromero in posizione sub-terminale; submetacentrici: centromero in posizione sub-mediana; metacentrici: centromero in posizione mediana.

Satelliti I satelliti sono elementi morfologici caratteristici, rotondeggianti o allungati, collegati all’estremità di un braccio attraverso un sottile filamento cromatinico. Talvolta il diametro di un satellite corrisponde a quello del braccio, altre volte è minore.

BANDEGGIO DEI CROMOSOMI Il bandeggio è definito come la variazione di proprietà di colorazione del cromosoma nella sua lunghezza. Utilizzando diverse metodiche di colorazione dei cromosomi è possibile osservare al microscopio ottico la produzione di un certo numero di bande, perfettamente riproducibili come numero, posizione ed estensione negli stessi cromosomi di cellule diverse provenienti dallo stesso individuo. (a) (b) Cariogrammi umani, colorazione Giemsa: non bandeggiato (a) o previo trattamento proteolitico (b: bande G).

Bande naturali: i cromosomi politenici. Sono visibili nei nuclei (interfase) di cellule delle ghiandole salivari dei ditteri (altamente specializzate ) per effetto dell’elevato numero di replicazioni del DNA + appaimento somatico degli omologhi. Sono caratterizzate dalla presenza di bande scure (regioni eterocromatiche) alternate da bande chiare, o interbande (regioni eucromatiche, trascrizionalmente attive).

Bande artificiali: Si ottengono attraverso particolari tecniche di colorazione che permettono di ottenere pattern di bandeggio diversi e caratteristici a seconda della metodica utilizzata; In ciascuna banda sono localizzate porzioni del genoma ben definite, codificanti e non, con dimensioni e posizione definite e costanti che sono caratteristiche e specifiche per ogni cromosoma del cariotipo di ogni specie. La bandeggiatura viene generalmente eseguita su cromosomi condensati di cellule in mitosi: cromosomi metafasici o prometafasici. cromosomi metafasici (più condensati e corti) o prometafasici (meno condensati, più lunghi) All’interno di un determinato cariotipo si possono osservare variazioni del numero di bande, per estensione e per morfologia, soprattutto in relazione al grado di condensazione dei cromosomi.

Nei vertebrati superiori, in cui è sempre possibile ottenere una bandeggiatura, le bande cromosomiche: riflettono in genere il livello di compattamento della cromatina: nel bandeggio G e in tutti i tipi di bandeggio “G-like”, le bande scure -o a colorazione più intensa, contengono regioni eterocromatiche; sono in relazione con la composizione in basi nucleotidiche del DNA (nel bandeggio G: bande scure=ricche in AT, bande chiare= ricche in GC); i geni attivi risiedono per lo più nelle bande chiare. Tutti i pattern di bandeggio comunque rivelano un differente livello di organizzazione della cromatina;

Cariogramma umano da gameti maschili, per lo studio del cariotipo eseguito per la presenza (sospetta) di anomalie cromosomiche. I cromosomi metafasici sono stati ottenuti attraverso tecniche di fusione cellulare e bandeggiati con fluorocromo (bande Q).

Il bandeggio può essere: Morfologico o Strutturale. Questo evidenzia una eterogeneità strutturale per: Dinamico o di replicazione. Permette di evidenziare una eterogeneità di tipo fisiologico: Distribuzione delle proteine Interazioni DNA/proteine Struttura della cromatina Periodo di replicazione del DNA Si ottiene attraverso incorporazione dell’analogo di base BrdU = bromodeossiuridina Può essere ottenuto attraverso: Trattamento proteolitico: bande G Trattamento termico: bande R bande T Bande G (replicazione tardiva) Bande R (replicazione precoce)

Morfologico o Strutturale. Bande cromosomiche Queste metodiche si sono sviluppate a partire dal 1970 e hanno permesso di riclassificare alcuni cromosomi poiché evidenziano un bandeggio cromosomico trasversale, specifico per ogni cromosoma. Esse non permettono solamente di distinguere cromosomi dotati di grandezza e morfologia simili, ma anche di individuare regioni specifiche con un enorme vantaggio nello studio delle anomalie. La bandeggiatura si può ottenere con sostanze fluorescenti, oppure si esegue la colorazione dopo digestione enzimatica o dopo denaturazione termica. A seconda della tecnica utilizzata, si distinguono bande Q, C, G o R. Le bande C, G e R sono basate sul fatto che un’area prossima al centromero si colora più intensamente col Giemsa rispetto al resto del cromosoma.

Cariogramma umano maschile (bandeggio Giemsa)

Cariogramma umano maschile: bandeggio DAPI. Bande Q: i cromosomi colorati con mostarda di Quinacrina, e osservati in fluorescenza, mostrano delle bande trasversali fluorescenti parallele, la cui disposizione è caratteristica per ciascun cromosoma. Esistono altre metodiche di colorazioni fluorescenti utilizzate per il bandeggio, tra cui il DAPI che produce un bandeggio di tipo G, l’Hoechst e altre. Cariogramma umano maschile: bandeggio DAPI.

(arancio di acridina; mitramicina). Con coloranti non fluorescenti Tecniche di bandeggio Il primo metodo di bandeggio è stato ottenuto con il fluorocromo mostarda di quinacrina, con l’obiettivo di dimostrare che lungo il cromosoma sono presenti differenze nella composizione delle basi (regioni ricche in AT o in GC). Le bande così ottenute sono chiamate bande Q. Il bandeggio con fluorocromi non è permanente a causa del decadimento della fluorescenza, perciò sono stati introdotti metodi che utilizzano altri coloranti non fluorescenti, per un bandeggio permanente. I metodi oggi più impiegati sono: Bande G Bande R/T Bande C NOR Organizzatori nucleolari o “reverse”: reg. telomeriche AT ricche centromeri Con fluorocromi mostarda di quinacrina (bande Q); Hoechst 33258; DAPI (arancio di acridina; mitramicina). Con coloranti non fluorescenti Bande G (tripsina + Giemsa); HCl; NaOH Ag

http://biomodel.uah.es/citogene/horwitz/cytogen1.htm

Bande C: queste bande vengono siglate da Constitutive, e si possono ottenere per denaturazione con una soluzione di urea riscaldata a 87°C Bande G: così chiamate perché richiedono una colorazione finale con Giemsa; i cromosomi vengono trattati a temperatura ambiente con una soluzione di enzimi (pronasi, tripsina, -chimotripsina); le bande ottenute sono simili alle bande Q. Bande R: sono il Reversal delle bande Q; si ottengono per denaturazione termica; i vetrini vengono immersi per 10-20 minuti in una soluzione di Earle a pH 6,5 riscaldata a 87°C, poi colorati con Giemsa. Bande T: sono un sottogruppo delle bande R, in cui sono evidenziati i telomeri e i centromeri. Impregnazione argento: il nitrato d'argento colora le proteine associate alla regione dell’organizzazione nucleolare. Questo produce una zona scura dove si deposita l'argento, che denota l'attività dei geni rRNA all'interno del NOR. Telomeri I telomeri sono le parti terminali di un cromosoma. Irradiando i cromosomi con raggi X si ottengono frammenti che si risaldano fra loro, ma non con il telomero, la cui struttura (se integra) ne impedisce l’attacco da parte sia di esonucleasi che di ligasi.

Bandeggio ad alta risoluzione Il numero di bande può variare in relazione al grado di condensazione dei cromosomi mitotici, e diminuisce con l’avanzamento della mitosi. I cromosomi di cellule arrestate in metafase, hanno un livello di condensazione massimo: in tali condizioni il pattern di bandeggio permette di ottenere un determinato numero di bande (a); Se il preparato cromosomico è arrestato in prometafase i cromosomi sono meno condensati e più lunghi: in queste condizioni il pattern di bandeggio evidenzia un numero maggiore di bande, più sottili (b): questo tipo di bandeggiatura è detto ‘ad alta risoluzione’. in metafase in prometafase (b) (a) Idiogrammi del cariotipo umano.

a) Idiogramma di cromosomi metafasici

bandeggio ad alta risoluzione. b) Idiogramma di cromosomi pro-metafasici Nel cariotipo umano le costrizioni secondarie (regioni NOR) sono presenti su 5 coppie di cromosomi: 13, 14, 15; 21, 22. In tutti questi cromosomi è presente anche il satellite, localizzato all’estremità del braccio corto (p).

BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONE: Nell’uomo il normale pattern di bandeggio di un assetto (n) presenta circa 300 bande G. Poiché per ciascuna banda di media grandezza corrispondono circa 100-150 geni, è improbabile che la delezione di 1 o pochi geni sia rilevabile dall’esame di cromosomi bandeggiati con tecniche comuni. Il cromosoma profasico, meno condensato, produce molte più bande: attraverso bandeggiatura di questi cromosomi è possibile ottenere una risoluzione massima, fino a 2000 bande/assetto aploide: BANDEGGIO AD ALTA RISOLUZIONE: scopi clinici: identificazione di difetti genetici pre- e perinatali; diagnosi di tumori. Nel normale bandeggio G si possono osservare da 300 a 850 bande scure, per genoma aploide; nel bandeggio ad alta risoluzione si può arrivare fino a circa 2000 bande.

- metafase tardiva: 300-400 bande - metafase precoce 400-700 bande 1 2 Il numero di bande che si possono identificare, per cariotipo aploide, dipende dallo stadio della mitosi in cui sono arrestate le cellule per il bandeggio cromosomico: - metafase tardiva: 300-400 bande - metafase precoce 400-700 bande - prometafase 700 -1000 bande - profase tardiva > 1000 bande

1 metafase tardiva (bande G)

2 metafase precoce (bande G)

prometafase 3 Cromosomi prometafasici ottenuti dalla tecnica per l’Alta Risoluzione (AR). In questa immagine è presente una delezione del braccio corto del cromosoma 6 (frecce): a sinistra il cromosoma normale e a destra il suo omologo deleto.

Per ottenere preparati per il bandeggio ad alta risoluzione è necessario ottenere la massima quantità di cellule in prometafase, in cui i cromosomi siano più allungati. Questo obiettivo si può ottenere: sincronizzando le cellule in coltura, utilizzando agenti che inibiscono la condensazione completa della cromatina (ad es. analoghi di base, agenti intercalanti). Il numero di bande ottenuto è molto maggiore rispetto a quello standard (750-1000 rispetto a 400-550) e consente uno studio più dettagliato.

Sistema I.S.C.N. (International System for Cytogenetic Nomenclature) Conferenza di Parigi, 1971: Sistema I.S.C.N. (International System for Cytogenetic Nomenclature) Per descrivere un cariotipo: Risoluzione: 850 bande Distinzione del cromosoma in 3 parti: 2 bracci, separati dal centromero; Bracci cromosomici: braccio corto “p” (petite), e braccio lungo “q” (queue); - Divisione dei bracci in ampie regioni (bande e interbande) indicate da numeri arabi, a partire dal centromero: p1, p2 (etc.) indicano il primo, secondo (etc.) gruppo di bande del braccio corto (p); q1, q2, qn indicano il primo, il secondo, l’ennesimo gruppo di bande del braccio lungo (q); Divisione delle regioni in bande e sottobande: (p11.1, p11.2, p12.1, etc.); Risoluzione: 400 bande Cromosoma HSA-11

numerate a partire dal centromero in direzione del telomero; Le bande maggiori, o bande di riferimento (landmark in inglese) vengono numerate a partire dal centromero in direzione del telomero; le bande più sottili sono numerate come suddivisioni dello spazio compreso tra le bande maggiori.   Idiogramma* del pattern di bandeggio G di cromosomi umani in metafase, che produce circa 400 bande per cariotipo aploide. I centromeri sono indicati dalle regioni sottili in grigio scuro che separano i bracci p e q di ciascun cromosoma. Nella figura è indicata solo la numerazione delle bande G-positive (ISCN, 1995.) * Termine usato in citogenetica: rappresentazione grafica schematica dell’assetto cromosomico aploide (n) di una specie animale o vegetale in cui ogni elemento è identificabile con numerazione da 1 a n.

Examples of G-banding patterns for chromosomes 5, 6, 7, and 8 at the 550-band stage of condensation. Band numbers permit unambiguous identification of each G-positive or G-negative band, e.g., chromosome 5p15.2 or chromosome 8q24.2. (Redrawn from ISCN, 1995.)

Metodologie di base per l’analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

1) allestimento di colture di linfociti umani

2) Preparazione dei vetrini: qualità del preparato

In campo chiaro (brightfield): 3) colorazione In campo chiaro (brightfield): Colorazione Giemsa, metodo Feulgen (selettivo per il DNA: permette la misurazione quantitativa), orceina acetica. Colorazioni aspecifiche (no bande): In fluorescenza (fluorescence): Fluorocromi: Bromuro di Etidio, DAPI, Hoechst 33258. Colorazione DAPI Colorazione Giemsa In campo chiaro (brightfield): Bande C, G, R, T; Ag-NOR; bandeggio AR. Bandeggio: In fluorescenza (fluorescence): Fluorocromi: DAPI (bande AluI: 1, 9, 16, 21 Y); Hoechst 33258. Bandeggio DAPI (Distamicina-DAPI) Bande G

4) Selezione delle metafasi (2) Buono il livello di condensazione dei cromosomi, ma troppo vicini, contorti e sovrapposti Buona la dispersione, ma troppo contratti (troppo tempo in colchicina)

Discrete, ma non ottimali soprattutto per la presenza di diversi cromosomi sovrapposti

Traslocazione Robertsoniana Bilanciata 15 13 10 7 45 Traslocazione Robertsoniana Bilanciata

ALLESTIMENTO DEL PREPARATO fitoemoagglutinina (stimola la crescita) colchicina (ultimi 30’) Ipotonica (20’) sangue periferico terreno di coltura centrifugazione 48-96h proliferazione centrifugazione pellet risospeso fissativo allestimento del preparato fissativo risospensione in poco fissativo pellet risospeso centrifugazioni (2-3)

Per il bandeggio dei cromosomi Viene eseguito un pre-trattamento del preparato cromosomico, cui segue la colorazione, che altrimenti risulterebbe omogenea lungo tutto il cromosoma. Il pre-trattamento dei cromosomi viene generalmente eseguito su preparati cromosomici già fissati su vetrino attraverso: enzimi proteolitici, o denaturazione al calore, e/o a pH fortemente acido o basico. In alcuni casi il trattamento può iniziare prima del fissaggio (cellule in coltura), ad esempio per l’incorporazione di analoghi di base in fase S. A seconda del grado di condensazione dei cromosomi si possono ottenere un numero diverso di bande: quest’ultimo è molto elevato nei cromosomi profasici, dove le bande sono anche più sottili (bandeggio ad alta risoluzione), mentre nei cromosomi metafasici le bande sono in numero minore e più spesse.

Nomenclatura 46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile Questa simbologia fornisce due informazioni: 1) il numero totale dei cromosomi (46) 2) il sesso dell’organismo (maschio se XY; femmina se XX). Esempi. 47 cromosomi (invece di 46), maschio = 2n + 1 cromosoma 21 soprannumerario (trisomia 21, o sindrome di Down) 47,XY,+21 46,XX,del(14)(q23) del=delezione 46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione 46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello) p p = braccio corto di un cromosoma q = braccio lungo q

Esempi applicativi delle tecniche di bandeggio Citogenetica clinica: diagnostica e studio di malattie genetiche Caratterizzazione di un cariotipo; Identificazione dei singoli cromosomi e isolamento di loci, di geni, di sequenze; polimorfismi cromosomici (esempi: polimorfismi per pattern di bandeggio di sequenze Alu, nell’uomo). Studi di citogenetica evoluzionistica: comparazione tra specie affini in relazione all’evoluzione del cariotipo. test di mutagenesi (sperimentale; in popolazioni esposte a mutageni/cancerogeni). Citogenetica popolazionistica: polimorfismi cromosomici Citogenetica evoluzionistica Mutagenesi: induzione di riordinamenti del cariotipo

CITOGENETICA clinica: Attraverso l’identificazione di cromosomi specifici nel cariotipo di una specie, il riconoscimento di rapporti posizionali di loci ed altre regioni, è possibile affrontare: 1) Studi di citogenetica diagnostica clinica: anomalie del cariotipo; diagnosi pre- e post-natale; infertilità; caratterizzazione cariologica di tumori.

Sindrome Cri du chat del(5)(p15.2 p15.3) Esempio: Delezione Sindrome Cri du chat del(5)(p15.2 p15.3) Quadro clinico [da Wikipedia] Tipico pianto, causato dall'ipoplasia delle cartilagini del laringe; ritardo mentale grave (con tendenza all'automutilazione), microcefalia, ipertelorismo marcato, epicanto, sella nasale slargata, micrognazia e orecchie a basso impianto. Nel 15% dei casi è presente una cardiopatia congenita. Cromosoma 5 normale Cromosoma 5 deleto

2) Polimorfismi (per pattern di bandeggio) Cariotipo umano (46, XX). Human metaphase chromosomes were subjected to fluorescence in situ hybridization with a probe to the Alu-sequence (green signals) and counterstained for DNA (red). [Bolzer et al., (2005). PLoS Biol 3(5): e157 DOI: 10.1371]

3) Studi comparativi tra genomi di specie affini: Karyotype Idiograms: Human (H) and Chimpanzee (C). Based on idiograms from "The Origin of Man: A Chromosomal Pictorial Legacy," Science, Vol. 215, March 19. 1982; pages 1525–1530. Stained with Giemsa during late prophase (1000-band) stage.

Comparative karyotype Da sinistra: HAS (uomo), PPA (scimpanzè), GGO (gorilla), PPY (pongo)

4) Studi di mutagenesi: valutazione di effetti mutageni di agenti ambientali; 1) valutazione del rischio di esposizione a mutageni per la salute umana (esposizione in atto e/o potenziale); 2) studio degli effetti mutageni di esposizioni pregresse; stima del rischio di esposizione per le popolazioni eventualmente esposte; B C A Aberrazioni cromosomiche strutturali in cellule di apici radicali di Vicia faba (A), fissate dopo trattamento con colchicina, ed in linfociti umani di individui esposti a raziazioni ionizzanti (B e C). A) traslocazione reciproca cromatidica; B) frammento circolare; C) cromosomi dicentrici.

Anni 60: nasce la Citogenetica Oncologica 1960: identificato un cromosoma “marcatore per la Leucemia mieloide cronica (CML): cromosoma Philadelphia t(9;22). Caspersonn 1972: Bandeggio dei cromosomi attraverso colorazione con mostarda di quinacrina (QM) intercalante fluorescente (bande Q). Denver 1966: l’uomo possiede ufficialmente 46 cromosomi organizzati in 7 gruppi.

CML, Leucemia Mieloide Cronica La CML è stata la prima malattia neoplastica dell’uomo in cui una specifica anomalia del cariotipo, il cromosoma Philadelphia (Ph), è stata associata alla generazione della leucemia. ABL BCR ABL/BCR BCR/ABL SI FORMANO DUE GENI DI FUSIONE: ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta); BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone cellulare) induce la trasformazione leucemica delle cellule staminali che portano la traslocazione. t(9;22)(q34;q11)

il gene di fusione BCR-ABL: È un oncogene che codifica per la proteina di fusione Bcr-Abl. A seconda della posizione precisa della fusione il peso molecolare della proteina può variare tra 185 e210 kDa. Per questo motivo BCR-ABL è talvolta chiamato P210 o P185. Tre varianti clinicamente importanti sono le isoforme p190, p210 e P230. BCR e ABL sono due kinasi: BCR è una serina-treonina kinasi; ABL è una tirosina kinasi. Nel gene di fusione BCR-ABL: l'attività tirosina-chinasi di ABL è più elevata di quella di ABL wild-type. Poiché ABL attiva un certo numero di proteine ​​ed enzimi che controllano il ciclo cellulare, il risultato della fusione BCR-ABL è quello di accelerare la divisione cellulare. Inoltre inibisce la riparazione del DNA, causando instabilità genomica e crisi blastica nella LMC.

Altre metodologie Altre tecniche permettono una marcatura di proteine specifiche o di sequenze specifiche lungo il cromosoma: per queste si ricorre a trattamenti con molecole come enzimi o anticorpi, o pretrattamenti con reagenti per la denturazione del DNA seguiti da trattamenti per l’ibridazione con sonde di DNA o RNA. Ibridazione in situ con sonde marcate di DNA/RNA (e.g. FISH); Enzimi di restrizione (ER); Tecniche immunocitochimiche (per i cinetocori, per basi specifiche, per conformazioni particolari del DNA come il DNA-Z, etc); Pattern di bandeggio per evidenziare parti del DNA in funzione del momento di replicazione (regioni “early-, middle- o late- replicating”): somministrando BUdR durante la fase S iniziale, media o tarda, e colorando con tecniche specifiche x BUdR. Nei vertebrati superiori produce un bandeggio G-Q ed R, ma può essere utile anche per caratterizzare i cromosomi di organismi che non mostrano pattern di bandeggio.

FISH: fluorescent in situ hybridization Cromosomi probe di DNA DENATURAZIONE IBRIDAZIONE

FISH: fluorescent in situ hybridization sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo cromosoma sul vetrino A T C G A T C G denaturazione doppia elica di DNA A T C G ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G osservazione del vetrino A T C G denaturazione A T C G T A G C

Preparazione della sonda di DNA Dimensioni. 10-25 nucleotidi (sonde più lunghe ibridano in modo meno specifico di altre ad estensione minore). Possono essere ottenute attraverso nick translation o tramite PCR. La sonda deve essere sufficientemente grande per ibridare in modo specifico con il suo ‘target’, ma non troppo grande da impedire il processo di ibridazione. La sonda viene poi marcata per la rivelazione del segnale. Possono essere utilizzati metodi: Diretti - marcatura con fluoroforo (fluorocromo) direttamente legato ad un nucleotide della sonda; Indiretti (preferibili) - il segnale è determinato dall'interazione di biotina o digossigenina legate ad un nucleotide sempre della sonda, con substrati (avidina/streptavidina o anticorpi anti-digossigenina) legati direttamente ad un fluorocromo. Questo metodo permette la visualizzazione di un segnale migliore e più intenso, rispetto ad una marcatura diretta del nucleotide della sonda.

Visualizzazione su microscopio a fluorescenza equipaggiato per l’analisi computerizzata di immagini. Le immagini di piastre metafasiche selezionate vengono acquisite e utilizzate per l’analisi del cariotipo (riarrangiamenti cromosomici criptici, microdelezioni e microduplicazioni). Multicolor Cromosome Banding (human karyotype)

Il grande vantaggio di questa tecnica è che la sequenza Le sonde possono essere acquistate sul mercato o prodotte in laboratorio da BACS (cromosomi batterici artificiali), che sono vettori utilizzati per la clonazione di segmenti di DNA. In genere la sonda viene selezionata sulla base di una presunta diagnosi clinica per chiarire dei risultati citogenetici precedenti. Il grande vantaggio di questa tecnica è che la sequenza può essere vista sia in metafase che in interfase. Lo svantaggio è che si rileva solo la sequenza di interesse, senza fornire informazioni sul resto del genoma. La tecnica FISH è utile anche per rilevare traslocazioni in interfase. Tkach-nuk Rowley ha sviluppato una strategia per identificare le traslocazioni in interfase usando sonde a sequenza unica. Sonda centromerica del cromosoma 7 : delle 2 cellule 1 è monosomica per il cromosoma 7. Possono essere utilizzate: sonde centromeriche (solo il marchio centromeri), sonde per interi cromosomi (‘chromosome painting’), sonde a sequenza locus-specifica, sonde telomeriche e subtelomeriche (per contrassegnare regioni in prossimità del telomero).

FISH & CHROMOSOME PAINTING FISH: cromosomi umani marcati con sonde di DNA centromerico cromosoma-specifiche. FISH: Mus musculus, telomeri marcati con sonde di DNA pantelomeriche di topo.

Metafase (colorazione DAPI) ibridata con sonda a sequenza unica per la rilevazione di microdelezioni del cromosoma 22. C'è un cromosoma 22 normale (in alto) con 2 segnali (rosso e verde) e l’altro deleto (in basso) con delezione della regione critica (segnale rosso: assente) per la sindrome da microdelezione del 22. Notare l’utilizzo di una sonda di controllo, visibile in un'altra regione dello stesso cromosoma (sonda con segnale verde). Il numero di sindromi da microdelezione e microduplicazione rilevate da sonde locus-specifiche è aumentato notevolmente negli ultimi anni. Alcune delle sindromi che possono essere diagnosticate sono: delezione 1p, Wolf-Hirschhorn, Cri du Chat, Sotos, Williams, Saethre Chotzen, CARICA, Langer Giedion, Pallister Killam, Prader Willi / Angelman, Rubinstein Taybi, Miller Decker, Smith Magenis, Di Giorgio / VCFS, la carenza di solfatasi steroidi, Cornelia de Lange, sindrome di Beckwith Wiedemann e di Charcot-Marie-Tooth.3

Preparati cromosomici di linfociti umani con ibridazione in situ (FISH)

Le sonde painting sono costituite da miscele di sequenze altamente specifiche caratteristiche di regioni distribuite lungo l’intera estensione di un particolare cromosoma; sono utilizzate per rilevare aberrazioni cromosomiche strutturali (AC) e numeriche in cui sono coinvolti. Le sonde sub-telomeriche (a differenza di quelle pan-telomeriche, che contengono le sequenze dei telomeri) contengono sequenze specifiche di DNA localizzate circa 100-300 kb dalla fine del cromosoma e sono utilizzate per l'identificazione di delezioni submicroscopiche telomeriche e riarrangiamenti. Queste regioni sono ricche di geni e sono spesso coinvolte in aberrazioni cromosomiche. E 'stato riportato che la frequenza di AC sub-telomeriche è del 5-6% nei soggetti affetti da ritardo mentale.

FISH: mouse painting probes FISH: human chromosome painting probes labeled with red (chromosomes 1,2,3) and green (chromosomes 4,8,12) for mutagenesis studies. FISH: MYCN gene amplification in neuroblastoma

M-FISH e SKY L'M-FISH (Multicolor FISH) e SKY (Spectral Karyotype) sono tecniche che permettono di visualizzare tutti i cromosomi, distinguibili per i colori diversi attribuiti ad ogni coppia, in un singolo test di ibridazione FISH di cromosomi in metafase con un cocktail di 24 sonde. Le differenze tra le due tecniche è solo negli equipaggiamenti utilizzati per la realizzazione. Il cariotipo SKY è utile per le neoplasie ematologiche e tumori solidi per chiarire riordinamenti complessi e per identificare l'origine di materiale cromosomico addizionale. È possibile rilevare riordinamenti intra-cromosomici quali inversioni, delezioni e duplicazioni, in quanto viene rilevato il cambiamento di colorazione lungo il cromosoma aberrante.

SKY e M-FISH sono tecniche di citogenetica molecolare che permettono la visualizzazione simultanea di tutti i cromosomi in colori diversi. (sonde chromosome-painting) Inizialmente vengono prodotte delle miscele di sonde cromosoma-specifiche (attraverso flow-sorting dei cromosomi che vengono poi amplificati); le sonde sono poi marcate in modo fluorescente. Sia SKY e M-FISH usano uno schema combinatorio di marcatura con fluorocromi spettralmente distinguibili, ma impiegano metodi diversi per la rilevazione e la distinzione tra le diverse combinazioni di fluorescenza dopo ibridazione in situ. In SKY, l’acquisizione delle immagini si basa su una combinazione di microscopia in epifluorescenza, Charge-Coupled Device (CCD) di imaging [dispositivo ‘accoppiato alla carica’] e spettroscopia di Fourier. Questo rende possibile la misura dell'intero spettro di emissione con una singola esposizione in tutti i punti dell'immagine. In M-FISH, vengono catturate immagini separate per ciascuno dei cinque fluorocromi usando filtri da microscopia passa-banda stretta; queste immagini vengono integrate con appositi software. In entrambe le tecniche, vengono assegnati ai cromosomi dei colori arbitrari unici , in base alle specifiche marcature dei fluorocromi. Le applicazioni di SKY e M-FISH per screening di genomi, per le aberrazioni cromosomiche in malattie umane e animali modello del cancro umano sono molteplici. SKY / M-FISH rendono possibile l'identificazione univoca di anomalie cromosomiche anche complesse e nascoste. Queste sono particolarmente utili in: Mappatura dei punti di interruzione dei cromosomi; Rilevamento di piccole traslocazioni; Identificazione di cromosomi marcatori, di HSR e cromosomi Double Minutes; caratterizzazione di riordinamenti cromosomici complessi. È ormai molto semplificata anche l'analisi dei cromosomi di topo, notoriamente difficile, grazie all'applicazione di SKY / M-FISH per la visualizzazione di aberrazioni cromosomiche in modelli murini del cancro umano.

SKY: Il metodo utilizza coloranti fluorescenti che si legano a specifiche regioni cromosomiche. Utilizzando una serie di sonde di DNA specifiche, ciascuna con diverse quantità di coloranti, le diverse coppie di cromosomi assumono caratteristiche spettrali uniche. Una caratteristica unica della tecnologia è l'uso di un interferometro per misurare spettri di luce emessa da coloranti fluorescenti. Piccole variazioni di colore, non rilevabili dall'occhio umano, vengono rilevate da un programma per computer che poi riassegna a ciascuna coppia di cromosomi un colore facile distinguere. Il risultato è una immagine digitale a colori. L’abbinamento dei cromosomi è più semplice perché le coppie di omologhi sono dello stesso colore, e le aberrazioni (ad esempio traslocazioni) sono riconoscibili più facilmente. Il cariotipo spettrale infatti è stato utilizzato per rilevare traslocazioni non riconoscibili attraverso l’ analisi tradizionale del bandeggio.

Outline of the spectral karyotyping (SKY) protocol Outline of the spectral karyotyping (SKY) protocol. SKY and multicolour fluorescence in situ hybridization (M-FISH) differ only in the method used to measure the spectral characteristics of each pixel in the image (see main text). Cot-1 DNA is enriched in repetitive sequences, and by binding to repetitive sequences in the fluorescently tagged probes, it suppresses their hybridization to target chromosomes. b | The application of SKY to normal interphase and metaphase human cells; c | The highly rearranged karyotype of a bladder cancer cell is shown. Arrows point to inter-chromosomal rearrangements. Panels a and b modified from Ref. 97 © (2000) Cambridge University Press. Panel c reproduced from Ref. 98 © (1999) Wiley Barbara J. Trask (2002) Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and counting. Nature Reviews Genetics 3, 769-778 | doi:10.1038/nrg905

Chial, H. (2008) Cytogenetic methods and disease: Flow cytometry, CGH, and FISH. Nature Education 1(1) Cytogenetic localization of DNA sequences with fluorescence in situ hybridization (FISH). a) FISH produces a fluorescent signal (red) at the sites of a specific DNA sequence; in this case, a 150-kb segment of chromosome 1. b) Several probes, each corresponding to a defined genomic segment, can be simultaneously analyzed and ordered with respect to each other using multicolor FISH.

SKY

La tecnica CGH (Comparative Genomic Hybridization) consiste nell'ibridazione contemporanea di due DNA in uguali proporzioni, uno di controllo e uno della cellula tumorale, marcati con fluorofori differenti, su un preparato cromosomico di cellule normali. Il DNA tumorale è marcato con fluorocromo verde e il DNA normale con un fluorocromo rosso. Il preparato cromosomico viene allora sottoposto ad una reazione di ibridazione ‘competitiva’ in cui: se la quantità di DNA dei 2 genomi è simile (segnali rossi e Verdi sono uguali come quantità di DNA marcato che riesce ad ibridare) il colore risultante è il giallo. se nel cariotipo da studiare (DNA verde) sono presenti delezioni o duplicazioni, vi sarà rispettivamente un’eccedenza di segnale rosso o di segnale verde: questa diversa quantità nella reazione competitiva sarà visibile nell’ibridazione del preparato cromosomico. La visualizzazione viene effettuata da un software, con cui si osservano i ‘guadagni’ e le ‘perdite’ mettendo a confronto le deviazioni del segnale rispetto ad un valore standard. Il vantaggio del CGH è che richiede il semplice uso di cromosomi metafasici, ma ha lo svantaggio di non dare informazioni di AC bilanciate.

L'array CGH (aCGH) è stato sviluppato sostituendo i cromosomi delle metafasi di riferimento con una matrice su cui sono ‘spottati’ cloni BAC o PAC di circa 150 Kb, corrispondenti a loci specifici del cromosoma di interesse.

La CGH è stata sostituita dalla tecnica a-CGH (array-Comparative Genomic Hybridization) o cariotipo molecolare, il cui principio è simile al CGH, ma l'ibridazione è effettuata su una matrice immobilizzata, o array, invece che su cromosomi fissati. I dati degli array vengono acquisiti e analizzati con un software appropriato che rileva le differenze nel numero di copie tra il DNA del paziente e il DNA di controllo. Il CGH-array consente di analizzare l'intero genoma in un singolo chip con una risoluzione molto alta, 10 volte superiore al bandeggio ad alta risoluzione, rilevando duplicazioni e le delezioni di materiale cromosomico.

Bandeggi dinamici o di replicazione

Bandeggi dinamici o di replicazione: permetteono di evidenziare una eterogeneità del pattern di bangeggio in relazione al periodo di replicazione del DNA Si ottiene attraverso l’incorporazione dell’analogo di base BrdU (bromodeossiuridina) somministrata alle cellule in divisione. Bande G (replicazione tardiva) Bande R (replicazione precoce) BrdU

1 2 Replicazione di regioni cromosomiche diverse in tempi differenziati