S.I.C.S.I. V ciclo CORSO DI LABORATORIO DI CHIMICA BIOLOGICA (prof. Andini) (prof. Andini) scuola interuniversitaria campana di specializzazione all’insegnamento Classe A013

Lo spettro è un grafico dell’intensità dell’assorbimento di una radiazione elettromagnetica in funzione della sua lunghezza d’onda. Generalmente lo spettro è ottenuto irradiando il campione con radiazioni monocromatiche di lunghezze d’onda via via crescenti e misurando l’assorbimento di ciascuna di esse. Gli apparecchi necessari a fare questo sono detti spettrometri. Uno spettrometro è formato da 5 componenti fondamentali:  Sorgente  Monocromatore  Compartimento celle  Rivelatore  Registratore

È la parte dell’apparecchio da cui prende origine la radiazione policromatica (contenenti cioè tutte le lunghezze d'onda del campo richiesto) che viene diretta sul campione.  per la regione del visibile si utilizzano lampade a incandescenza (a filamento di tungsteno)  per la regione UV si usano lampade a deuterio, costituite da un'ampolla di quarzo contenente deuterio gassoso a bassa pressione in cui viene fatta passare una scarica di corrente elettrica. SORGENTE

Monocromatore Serve a selezionare la radiazione elettromagnetica di una particolare lunghezza d’onda tra tutte quelle prodotte dalla sorgente. Esso cioè «scompone» la radiazione policromatica in bande il più possibile monocromatiche. I primi monocromatori erano basati sul prisma di vetro che come è noto è in grado di scomporre la luce bianca nelle sue componenti colorate grazie al fenomeno della rifrazione: quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro subisce una deviazione di un angolo inversamente proporzionale alla della radiazione (cioè, radiazioni con diversa λ subiscono diversa deviazione). Fenditura d’uscita

Negli attuali apparecchi si usa come monocromatore un reticolo di diffrazione. Esistono due tipi di reticoli di diffrazione: Reticoli a riflessione: sono costituiti da una serie di solchi paralleli tracciati sopra una superficie riflettente Reticoli a trasmissione: sono costituiti da una serie di sottilissime fenditure parellele e molto vicine fra loro (la distanza fra due fessure adiacenti deve essere dello stesso ordine di grandezza della radiazione incidente)

Cella È la componente destinata a contenere il campione da esaminare; in generale la sostanza che vogliamo esaminare è sciolta in un determinato solvente e messa in un contenitore chimato cuvetta o cella. Questo contenitore deve essere trasparente alla radiazione elettromagnetica che a noi interessa. Nella spettroscopia UV si utilizzano cuvette di quarzo. La lunghezza del tratto che la radiazione elettromagnetica percorre attraversando il campione è detta cammino ottico e dipende dalla forma e dimensioni della cuvetta. b Raggio incidenteRaggio emergente

Rivelatore e Registratore È un dispositivo capace di generare un segnale elettrico quando è colpito da una radiazione elettromagnetica. Il segnale elettrico è proporzionale alla intensità della radiazione elettromagnetica. Il segnale in uscita dal rivelatore può essere utilizzato direttamente per tracciare uno spettro usando un registratore. In questo dispositivo il segnale del rivelatore controlla la posizione di un pennino che scrive su una striscia di carta in movimento. Tuttavia oggi gli apparecchi sono interfacciati con un computer che regola il monocromatore, registra in memoria i valori di assorbimento alle varie frequenze, elabora i dati ottenuti e li stampa su carta.

TIPI DI SPETTROMETRI Esistono diversi tipi di spettrofotometro, a seconda di come sono organizzate le varie componenti: SPETTROMETRI MONORAGGIO SPETTROMETRI A DOPPIO RAGGIO

Spettroscopia UV: definizioni Cromoforo: la parte della molecola responsabile dell'assorbimento UV (per esempio, un carbonile α,β insaturo) Gruppo auxocromo: Un gruppo che non è di per sé un cromoforo, ma può modificare l'intensità e la lunghezza d'onda di assorbimento di un cromoforo (i gruppi con doppietti di non legame come –OH;-NH 2 sono tipici auxocromi) Shift batocromico: Consiste nello spostamento a lunghezze d’onda più alte (verso il rosso) della max. Tale effetto dipende dalla presenza di gruppi funzionali, detti appunto batocromi, nelle adiacenze del cromoforo, come può essere un doppio legame in α a un carbonile. Shift ipsocromico: Consiste nello spostamento a lunghezze d’onda più basse (verso il blu) della max. Tale effetto dipende dalla presenza di gruppi funzionali, detti appunto ipsocromi, nelle adiacenze del cromoforo, che ne diminuiscono la delocalizzazione elettronica. Classico è il caso dell’anilina in ambiente acido, dove è presente come ione anilinio (anche se questo è più giusto dirlo effetto pH). Effetto ipercromico: aumento dell'ε della transizione Effetto ipocromico: diminuzione dell'ε della transizione

Assorbimento UV dei composti organici  Alcani Hanno solo legami  e non hanno coppie di elettroni di non legame. Per questa ragione sono trasparenti all’UV a tutte le lunghezze d’onde  Composti saturi contenenti eteroatomi Questi composti (alcoli, eteri, ammine,tioli, solfuri) possono avere transizioni n , di energia minore rispetto alle . Tuttavia questi assorbimenti cadono ancora nel lontano UV, o al limite intorno ai 200nm, per cui sono di scarsa utilità pratica.  Alcheni Gli alcheni isolati (cioè non coniugati) possono presentare transizioni di tipo , ma assorbono ancora nel lontano UV. Per esempio l’etilene ha una max di 175nm. Tuttavia l’assorbimento di alcheni più sostituiti (con gruppi alchilici) si sposta verso lunghezze d’onda più alte (shift batocromico). Anche eteroatomi direttamente legati al doppio legame possono dare notevoli shift batocromici a causa della possibilità di coniugazione     n

 Alcheni coniugati Questi composti assorbono nel vicino UV, a lunghezze d’onda tanto maggiori quanto più grande è il numero di doppi legami coinvolti nella coniugazione..C C H H HH max 165 nm max 165 nm H C CHH C C H H H C C H CH 3 H H C C H3CH3CH3CH3CH C C H H max 217 nm max 217 nm max 263 nm max 263 nm

La coniugazione abbassa l’energia tra l’orbitale molecolare occupato a più alta energia (HOMO) e l’orbitale molecolare non occupato a più alta energia (LUMO)

TRANSIZIONI π  π* Danno luogo alle cosidette bande K (dal tedesco Konjugierte) Hanno coefficienti di estinzione molare alti ( ~10 4 ) La max dipende da: numero di doppi legami sostituenti sul sistema coniugato presenza di cicli

Regole di Woodward-Fieser per sistemi Dienici Sono regole semiempiriche con le quali è possibile prevedere la max di assorbimento max calcolate (±5) omoannulare eteroannulare

 Aldeidi e chetoni Il gruppo carbonilico presenta, oltre al legame , due coppie di elettroni di non legame. Esso perciò avrà due transizioni :  che per un composto carbonilico non coniugato cade nel lontano UV (λ max intorno ai 150 nm). n  che per la maggiore energia degli elettroni negli orbitali di tipo n cade nel vicino UV, in genere tra i 270 ed i 300 nm. Tuttavia questa transizione (chiamata banda R) è molto debole, con ε minore di 30. La lunghezza della banda R di un chetone risente della natura dei gruppi alchilici legati al carbonile, ma non permette di ricavare importanti informazioni strutturali (è spesso nascosta da transizioni più intense)

 Aldeidi e chetoni α,β insaturi Questi composti presentano intense bande K ( relative a transizioni  ) nel vicino UV; Le tipiche λmax vanno da 215 a 250 nm. Inoltre è presente la debole banda R dovuta alle transizioni n  dei doppietti elettronici dell’ossigeno, che è spostata a lunghezze d’onda più elevate ( nm) rispetto ai composti carbonilici non coniugati per la minore energia del primo orbitale  *.

ESEMPIO Chetone aciclico215 nm Gruppo alchilico in α 10 Gruppo alchilico in β 2x12=24 calcolato249 osservato249

 Benzene e derivati Nel benzene i 6 orbitali p dei sei carboni si combinano tra loro per dare orbitali molecolari estesi all’intera molecola: si formano 3 orbitali di legame π e 3 orbitali di antilegame π*. Sono quindi possibili varie transizioni π π*. In particolare il benzene presenta 3 bande di assorbimento: BANDE λ ε E E B La banda più interessante è la B che cade nel vicino UV.

Si è visto sperimentalmente che : -sostituenti alchilici sull’anello benzenico causano un leggero shift batocromico della banda B, che aumenta all’aumentare dei sostituenti fino all’esametil benzene che assorbe a λ max 272nm. -gruppi auxocromici come –OH e -NH 2 causano uno shift batocromico ed un aumento della intensità della banda B Valore base203.5 sostituentiincrementi CH nm CN20.5 nm CHO46.0 nm COCH nm COOH25.5 nm Cl6.0 nm NH nm OH7.0 nm Br6.5 nm

Un aspetto interessante degli spettri UV di derivati fenolici e anilinici è la loro dipendenza dal pH. L’ossidrile fenolico è piuttosto acido (Ka 9) e può essere deprotonato da basi acquose o alcoliche diluite. Il risultante ione fenato ha bande B spostate a lunghezze d’onda maggiori perché l’O - è un elettrondonatore migliore dell’OH. Quindi uno shift batocromico per aggiunta di una base è un buon indizio di una struttura fenolica.

Le aniline sono leggermente basiche e possono essere convertite nei relativi cationi per aggiunta di acidi diluiti. Una volta protonato, il gruppo amminico non ha più una coppia di elettroni da donare all’anello aromatico, per cui lo spettro UV dell’anilina diventa molto simile a quello del benzene. Quindi uno shift ipsocromico per aggiunta di acidi è un buon indizio di una ammina aromatica.

Usi – Identificazione di composti – Rilevamento di composti – Misure di concentrazione (uso della legge di Beer-Lambert)

ANALISI QUANTITATIVA Condizioni: La specie chimica da analizzare deve presentare un cromoforo nella sua struttura La specie chimica, pur non presentando un cromoforo nella sua struttura, deve poter dare trattata con un opportuno reagente(cromogeno), una nuova specie chimica presentante un cromoforo

METODO GRAFICO DELLA RETTA DI TARATURA Si procede nel seguente modo:  Si preparano diverse soluzioni a concentrazione nota della specie chimica da analizzare.  Si fissa la lunghezza d’onda desiderata  Si azzera e si tara lo spettrofotometro con un bianco  Si leggono le assorbanze delle soluzioni a concentrazione nota  Si riportano i valori di A in funzione della concentrazione e si traccia la retta di taratura  Mediante interpolazione si risale alla concentrazione del nostro campione incognito.