XXXII CONVEGNO NAZIONALE Società Italiana di Chimica Agraria Utilizzo virtuoso di biocidi naturali nella conservazione dei manufatti d’interesse storico-culturale Scrano L.1, L. Milella2, S. Milan2,3 , G. Napolitano2,3, F. Lelario2, M. G. Bonomo2 e S.A. Bufo2 1Dipartimento delle Culture Europee e del Mediterraneo. 2Dipartimento di Scienze e 3Dottorato di Scienze, Università della Basilicata Potenza, Italy INTRODUZIONE Il biodeterioramento del patrimonio culturale è il risultato dell’azione combinata di diversi agenti (es. alghe, cianobatteri, batteri e funghi unicellulari e filamentosi) che svolgono un ruolo importante nella trasformazione strutturale dei monumenti di pietra, provocando ingenti danni estetici, fisici e chimici (Lamenti et al. 2000, Crispim & Gaylarde 2005). I tentativi di eliminazione dei biodeteriogeni devono, naturalmente, essere preceduti da approfondita valutazione: - della biodiversità presente sul manufatto artistico/storico, - del suo valore storico-ambientale, dei rischi per la conservazione dell’opera stessa, - della durata temporale dell’effetto dell’intervento. I metodi più semplici per la rimozione dei biodeteriogeni sono quelli meccanici, fisici, chimici ma recentemente, nell’ottica di salvaguardare ambiente e salute umana, sono sperimentati metodi biologici che utilizzano sia specie parassite e antagoniste dei biodeteriogeni sia prodotti del metabolismo secondario di microorganismi e/o di piante. In questo lavoro è stata testata in vitro la bio-attività di metaboliti secondari prodotti da Trichoderma harzianum (strain T-22) e Trichoderma asperellum (strain B1) e da Cannabis sativa varietà Futura 75 e Uso 31 su colonie batteriche (genere Bacillus) e fungine (Rhizoctonia solani e Fusarium oxysporum) colonizzatrici di due ponti siti in Potenza e provincia. Gli estratti di Cannabis sativa sono stati ottenuti da fiori, foglie e semi estraendo i principi attivi con solventi a polarità crescente. Test Antifungini Test Antibatterici Gli estratti di C. Sativa, dopo aver eliminato il solvente di estrazione mediante evaporatore rotante, sono stati ripresi in etanolo. MATERIALI & METODI E’ stato adoperato Potato Dextrose Broth (PDB) come substrato di coltura liquido di Trichoderma T-22 e B1. Il brodo è stato filtrato a 0.2 mm dopo 15 giorni ed utilizzato per l’inoculo. Test Antifungini Test Antibatterici I filtrati (privi dunque di cellule di entrambi i funghi) sono stati preparati previa crescita dei microrganismi in PDB per 5 e 15 giorni. Tutti i principi attivi sono stati identificati utilizzando sia cromatografia liquida sia cromatografia gassosa accoppiata alla spettrometria di massa (dati non riportati in questo poster) L’attività antifungina di tutte le sostanze è stata testata su Rhizoctonia solani (strain T604) e Fusarium oxysporum (strain T1357) funghi patogeni localizzati sui due manufatti. I filtrati sterilizzati di Trichoderma sono stati mescolati con Potato Dextrose Agar (PDA) nei rapporti 1:4 e 1:1 ed inoculati al centro della piastra Petri, analogo procedimento è stato utilizzato per gli estratti di C. sativa. Quindi è stato misurato il diametro della colonia e calcolata la percentuale di inibizione della crescita radiale (PIRG) rispetto al controllo . PIRG = 𝓡𝟏−𝓡𝟐 𝓡𝟏 x 100 PIRG = 𝑅1 −𝑅2 𝑅1 x100 L’attività antibatterica di tutte le sostanze è stata valutata su diversi ceppi di Bacillus (phylum Firmicutes). Ogni isolato batterico è stato mescolato con plate count agar (PCA) a caldo e versato su una piastra di Petri. Sono stati effettuati pozzetti (5 mm ) ai quali sono stati aggiunti 50 l di ciascun estratto di C. sativa e di ciascun filtrato privo di cellule. Le piastre sono state incubate a 30 ° C per 3 giorni. Il diametro (cm) della zona di inibizione apparso è stata misurata. Il filtrato privo di cellule di T. harzianum T-22 cresciuto in potato dextrose broth (PDB) per 5 giorni inibisce la crescita di B. cereus (A1I, A22-1I e A10-2II) e B. amilolyquefaciens (A5TI). Il filtrato privo di cellule di T. harzianum T-22 cresciuto in PDB per 15 giorni inibisce la crescita di B. cereus (A1I, A4I, A22-2I e A19-1I) e B. amilolyquefaciens (A5TI e A10-2II) . Il filtrato privo di cellule di T. asperellum (B1) cresciuto in PDB per 5 e 15 giorni non ha mostrato alcuna attività antibatterica nei confronti dei diversi generi di Bacillus. Gli estratti di C. Sativa varietà Futura 75 ed Uso 31 mostrano attività inibitoria della crescita a 24h, 48h e 72h nei confronti di B. cereus (A1I e A4I), B. amyloliquefaciens (A3-2 I) e B. thuringiensis (B7I2) (Fig 3). Il B. symplex (B8tII) non risulta sensibile ad alcun tipo di trattamento. Fig. 1. Test antifungino di Trichoderma harzianum T-22 contro R. solani. La crescita radiale è stata confrontata con il controllo (foto a sinistra): a) concentrazione del brodo al 20%. b) concentrazione del brodo al 50%. 3a 3c 3b 1a 1b Fig. 2. Test antifungino di Trichoderma asperellum contro R. solani. La crescita radiale è stata confrontata con il controllo (foto a sinistra): Concentrazione del brodo al 20%. concentrazione del brodo al 50%. Fig.3 Test antibatterico di estratti da C. sativa con: a) n-Esano contro B. thuringiensis; b) Cloroformio contro B. thuringiensis; c) n-Esano contro B. cereus; d) Cloroformio contro B. cereus; e) n-Esano contro B. amyloliquefaciens. 3d 3e 2a 2b RISULTATI Entrambi gli strain di T. harzianum e T. asperellum hanno evidenziato la loro bioattività: T. harzianum in generale è più aggressivo del T. Asperellum sia contro i batteri sia contro i funghi. Gli estratti di C. sativa hanno evidenziato una maggiore attività inibitoria verso le colonie batteriche rispetto alle fungine, confermando quanto riportato in letteratura (Ali, Esra et al, 2012) Questi risultati possono aprire interessanti prospettive sulla possibilità di utilizzare bio-materiali per la formulazione di eventuali prodotti commerciali. Tali formulati avrebbero il vantaggio di essere meno pericolosi dei biocidi di sintesi per la salute dell’uomo e degli animali, di non avere impatto ambientale negativo, di essere bio-degradabili, ed in più di essere compatibili con i materiali utilizzati nella costruzione delle opere d’interesse storico-culturale. References -Crispim, C.A. & Gaylarde, C.C. 2005. Cyanobacteria and biodeterioration of cultural heritage: A review. Microbial Ecology 49: 1-9. -Lamenti, G., Tiano, P. & Tomaselli, L. 2000. Biodeterioration of ornamental marble statues in the Boboli Gardens (Florence, Italy). Journal of Applied Phycology 12: 427-433. Si ringraziona i Dott.ri Sasso Sergio, Ligrani Giovanni e Caligine Giampiero per l’ausilio pratico profuso nell’attuazione dei saggi biologici e dell’analisi strumentale.